Random-Mutagenesis und Directed Evolution von Vitellogenin

Antragsteller: Kilian Fynn Klaus
Projektbeteiligte: Kilian Fynn Klaus, Hannah Pies, Phil Holtbernd
Fachbereich, Studienrichtung: FB 13 Biologie
Projekttitel: Random-Mutagenesis und Directed Evolution von Vitellogenin
Fördersumme: 5.000,00 €
Kontakt: kilian.klaus@uni-muenster.de

Projektbeschreibung:

Das Projekt wurde im Rahmen des diesjährigen Teams der Universität Münster bei der Teilnahme am iGEM-Wettbewerb 2023 durchgeführt. In diesem Jahr hat sich das Team dem Problem des Bienensterbens gewidmet und dazu beigetragen, eine effizientere und natürliche
Lösung zur Bekämpfung eines des bedeutsamsten Bienenparasiten, der Varroamilbe, zu entwickeln.

Dazu sollte eine optimierte Variante des Bienenprotein Vitellogenin synthetisch hergestellt werden. Dieses synthetische Vitellogenin könnte die Immunabwehr der Bienen insbesondere gegenüber entomopathogenen Pilzen deutlich verbessern und eine vereinfachte Bekämpfung der Varroamilbe ermöglichen. Aktuelle Methoden zur Bekämpfung der Varroamilbe nutzen meist organische Säuren oder andere chemischen Bekämpfungsmittel. Diese sind zwar effektiv, haben jedoch einige gravierende Nachteile. Zum einen sind sie nicht vollständig effektiv in ihrer Bekämpfung der Milben, wodurch das Volk regelmäßig behandelt werden muss, um die Varroa, Populationen und Kontrolle zu halten. Zum anderen birgt ihre Nutzung ebenfalls Gefahren für die Bienen. Eine zu hohe Dosierung kann dem Volk ebenfalls erheblichen Schaden zufügen. An dieser Stelle könnten entomopathogene Pilze einen alternativen Ansatz darstellen. Diese wurden bereits in voran gegangen, Studien höchst effizient genutzt, um Varroamilben in Bienenstöcken abzutöten. Leider sind die Pilze auch in geringem Umfang für die Bienen schädlich. Dies könnte jedoch durch eine Immunisierung der Bienen gegen die Pilze verhindert werden.

Das Teilprojekt Random-Mutagenesis und Directed Evolution von Vitellogenin hatte zum Ziel, fehlendes Wissen über die Struktur des Vitellogenins aufzuklären und so Ansatzpunkte für die Optimierung zu liefern. Dafür standen vor allem die Bindungseigenschaften des Vitellogenins gegenüber PAMPs (Pathogen- associated molecular patterns) im Vordergrund. Diese Bindungsaktivitäten spielen eine zentrale Rolle in der Immunabwehr der Bienen. Durch Nutzung eines Yeast-Surface-Displays sollten unterschiedliche Domänen des Vitellogenins, von Saccharomyces cerevisiea exprimiert und auf der Oberfläche präsentiert werden. Mithilfe von Antikörper-Labelling und anschließender FACS (Fluorescence activated cell sorting) - Analyse werden die Zellen dann nach ihrer Bindungsaktivität gegenüber den PAMPs sortiert, was Rückschlüsse auf die Bindungsstellen und Funktion der Domainen des Proteins erlaubt. Basierend darauf sollten durch Error-prone-PCRs verschiedene zufällige Mutationen in die Sequenz des Vitellogenins integriert werden. Die dadurch erzeugte Zell- Libary aus verschiedensten Varianten der Proteindomänen ermöglicht die Isolation von Domänen mit verbesserter Bindungsaffinität zu den PAMPs.

Die Durchführung des Projektes innerhalb des iGEM- Wettbewerbs hat zu vielversprechenden Forschungserkenntnissen geführt und unser Team als auch die Forschung in diesem Bereich entscheidend vorangebracht. Alle Ergebnisse wurden dabei detailliert auf dem Wiki als Bewertungsgrundlage für den Wettbewerb beschrieben und festgehalten und können jederzeit zugänglich nachgelesen werden (https://2023.igem.wiki/unimuenster). Wir konnten in der FACS-Analyse eine erhöhte Bindungsaffinität für bestimmte Domänen des Proteins charakterisieren und so den Ansatzpunkt für die Optimierung festlegen. Die Ergebnisse legen eine Rolle der DUF-Domaine in der Bindung von PAMPs nahe, welche unseres Wissens, zuvor nicht beschrieben war. Leider war es uns, auf Grund des vom Wettbewerb vorgegebenen Zeitumfangs, nicht möglich, das Projekt bis zur Isolation verbesserter Varianten umzusetzen.

Darüber hinaus konnten alle teilnehmenden Studierenden ihre Fähigkeiten durch den einzigartigen Lernprozess, welchen ein derartig selbst entwickeltes Projekt mit sich bringt, erheblich erweitern. Im Verlauf des Projektes standen wir stehts in engen Kontakt zu Vertretern der Forschung, Wirtschaft und Naturschutzverbänden aus aller Welt. Ihre Expertise war für die Gestaltung des Projektes von zentraler Bedeutung. Das eigene Projekt von der Idee, über die Umsetzung mit einigen Hürden bis hin zur Präsentation der Ergebnisse auf einer internationalen Konferenz mit 400 Team und 4.000 Teilnehmern wachsen zu sehen, ist eine bereichernde Erfahrung für alle gewesen und in dieser Form in einem normalen Studienverlauf unmöglich zu replizieren. Das erhaltene Feedback durch Besucher der Messe zu unserer Präsentation des Projektes und der Ergebnisse war sehr positiv und lässt uns alle sehr gerne auf die Zeit zurückblicken.

Der Prozess der Antragsstellung war mit mehrfachen, iterativen Anpassungen und Konkretisierungen des Antrages verbunden und hat dadurch eine genauere Abgrenzung und zielgerichtete Planung ermöglicht. Die erhaltene Förderung hat es ermöglicht, den Forschungsstandpunkt zu Vitellogenin als Immunprotein zu vertiefen und so die Grundlage für einen möglichen Lösungsansatz zur Bekämpfung der Varroamilbe geschaffen. Dabei wurde die Sichtbarkeit des großen Problems des Bienensterbens erhöht und auf internationaler Bühne im Rahmen des iGEM-Wettbewerbs diskutiert. Mithilfe der Förderung dieses Teilprojektes konnte das iGEM-Team 2023 der Universität Münster erfolgreich am Wettbewerb teilnehmen. Entscheidend ist aber auch das persönliche Wachstum an der Umsetzung dieses Teilprojekt, das alle Beteiligten auf ihrem Weg als Forschende begleiten wird.

Insbesondere gilt der Dank für die Unterstützung bei diesem Projekt Frau Linda Dieks und Frau Claudia Ehlert, die auf alle Fragen und Änderungswünsche immer eine Antwort parat hatten. Viele Schwierigkeiten in der Materialbeschaffung und im Projekt hätten ohne Ihre Ratschläge nicht behoben werden können. Herzlichen Dank für diese Erfahrung!