Entwicklung einer innovativen Hochdurchsatzmethode zur Optimierung des Mevalonat-Stoffwechselweges

Antragsteller: Louis Noel Schanzmann, Tobias Bröker
Fachbereich, Studienrichtung: FB 13 Biowissenschaften
Projekttitel: Entwicklung einer innovativen Hochdurchsatzmethode zur Optimierung des Mevalonat-Stoffwechselweges
Fördersumme: 4996,93 €
Kontakt: l_scha63@uni-muenster.de

Projektbeschreibung:

Das Projekt wurde nach Abschluss des iGEM-Wettbewerbs 2022 initiiert, um die dort erkannten Limitierungen im Mevalonat-Stoffwechselweg (MVA) unabhängig von den laufenden Projekten der Arbeitsgruppen weiter zu untersuchen. Im Fokus stand die Frage, ob sich durch den gezielten Einsatz verschiedener Enzymkombinationen bekannter HMGR-Varianten aus unterschiedlichen Organismen der MVA-Ertrag in Hefe steigern lässt. Ein zentrales Problem bei der Arbeit mit dem MVA-Weg in Saccharomyces cerevisiae ist das sogenannte "Bottleneck-Enzym" HMGR (3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-Reduktase). Dieses Enzym katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im MVA-Zyklus und ist seit Langem Gegenstand intensiver Forschung. In der Vergangenheit wurden bereits zahlreiche HMGR-Mutanten entwickelt, die diese limitierende Wirkung deutlich verringern. Uns fiel jedoch auf, dass bisher kaum in Erwägung gezogen wurde, ob es möglicherweise in anderen Organismen HMGR-Varianten gibt, die von Natur aus weniger reguliert oder effizienter sind. Im Rahmen unserer Recherche identifizierten wir daher HMGR-Gene aus verschiedenen Pflanzenarten, die mit dem Nagoya-Protokoll kompatibel sind und somit für Forschungszwecke verwendet werden dürfen.

Da die Zahl der möglichen Enzymkombinationen sehr hoch ist, benötigten wir ein Hochdurchsatzverfahren, das bisher in dieser Form nicht existierte. Deshalb war ein Teil unseres Projekts die Entwicklung eines neuen Vektorsystems, mit dem sich HMGR-Varianten schnell, effizient und funktional austesten lassen. Als Reporter-Molekül wählten wir Lycopin, ein farblich gut sichtbares, ungiftiges Carotinoid, das sich hervorragend zur quantitativen Auswertung eignet. Lycopin kann über ein Enzymcluster bestehend aus drei Proteinen aus dem MVA-Stoffwechselweg synthetisiert werden. Dieses Cluster isolierten wir aus der Hefe Phaffia rhodozyma und planten, es auf ein High-Copy-Plasmid für Hefe zu klonieren. Zusätzlich integrierten wir in unseren Vektor eine Multiple Cloning Site (MCS), die für Gibson Assembly optimiert ist. Damit sollte ein schneller und präziser Austausch verschiedener HMGR-Varianten möglich sein.

Im Verlauf des Projekts konnten wir erste vielversprechende Ergebnisse erzielen. So gelang es uns, Lycopin erfolgreich in Hefe zu produzieren und mehrere pflanzliche HMGR-Gene zu isolieren und klonieren. Die funktionale Kombination des HMGR-Moduls mit dem Lycopin-Cluster in einem funktionsfähigen Vektor konnte bis zum Projektende jedoch noch nicht vollständig abgeschlossen werden.

Trotzdem war das Projekt für uns ein voller Erfolg:
Wir konnten zahlreiche Methoden testen, Teilziele erreichen und wichtige Erfahrungen im eigenständigen wissenschaftlichen Arbeiten sammeln. Die intensive Planung, Recherche und Diskussion innerhalb des Teams halfen uns, Ideen kritisch zu hinterfragen und unsere finale Projektstrategie stetig zu verbessern. Auch wenn nicht alle technischen Hürden vollständig überwunden werden konnten, blicken wir sehr positiv auf das Projekt zurück – sowohl fachlich als auch persönlich.

Unser besonderer Dank gilt Prof. Jochen Schmied und seiner Arbeitsgruppe, die uns nicht nur die nötigen Räumlichkeiten zur Verfügung gestellt haben, sondern uns auch bei methodischen und technischen Fragen tatkräftig unterstützt haben.