Praktikum für Chemie- und Biologie-Leistungskurse

Genetischer Fingerabdruck

In diesem Praktikum wird mit Hilfe einer PCR (Polymerasekettenreaktion) aus dem Erbgut der Versuchsteilnehmer ein Abschnitt des Amelogenin-Gens vervielfältigt. Mit einem Wattestäbchen wird dazu DNA aus den Zellen der Mundschleimhaut entommen, unter Verwendung geeigneter kurzer DNA-Sequenzen dann (Primer) vermehrt und anschließend gelektrophoretisch analysiert. 

Polymerasekettenreaktion (PCR)

Pcr 180Mit der Methode der PCR lassen sich Nukleinsäureabschnitte durch Einsatz von hitzestabilen DNA-Polymerasen in großer Menge vervielfältigen. Als Ausgangsmaterial reichen dabei geringste Mengen Ausgangs-DNA aus, die in diesem Praktikum aus Zellen der Mundschleimhaut gewonnen werden. Voraussetzung für die gezielte Vermehrung einer bestimmten Nukleotidsequenz ist die Kenntnis ihrer flankierenden Bereiche. Durch Zugabe von synthetisch erzeugten Primern, die komplementär an die flankierenden Bereiche der Zielsequenz binden können, wird es der DNA-Polymerase ermöglicht, diesen Bereich zu vervielfältigen. Während der PCR müssen die Doppelhelices zunächst voneinander getrennt werden (Denaturierung), dann erfolgt die Anbindung (Hybridisierung) der Primer. Anschließend bindet die DNA-Polymerase an die Primer und synthetisiert von diesen ausgehend den komplementären DNA-Strang (Elongation). Durch die Wiederholung von mehreren Zyklen hintereinander kommt es zur exponentiellen Vermehrung der von den Primern flankierten DNA-Sequenz. Diese Vervielfältigung ist notwendig, um ausreichend große Mengen der Ziel-DNA für die spätere Analytik, die Gelelektrophorese, zu generieren.

Gelelektrophorese

Elektrophorese 180Das Elektrophorese-Prinzip beruht auf der Wanderung von geladenen Probemolekülen (Ionen) unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes. In diesem Versuch werden die während der PCR vermehrten negativ geladenen DNA-Fragmente im elektrischen Feld nach ihrer Molekülmasse getrennt. Als Trägermaterial dient Agarose, es handelt sich hierbei um ein Polysaccharid (Mehrfachzucker), das aus der Zellwand von Rotalgen gewonnen wird. Die Konzentration der eingesetzten Agarose entscheidet über die Größe der Siebporen und damit über den Reibungswiderstand, den die Agarose den durch sie wandernden DNA-Fragmenten entgegenstellt. Kleine Moleküle bewegen sich schneller durch das Gel als große, wodurch eine Trennung der Moleküle nach ihrer Größe (Molekulargewicht) ermöglicht wird. Die DNA im Agarosegel lässt sich mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Ethidiumbromid, der spezifisch DNA bindet, im UV-Licht detektieren. Die Bandengröße und Verteilung gibt Aufschluss über charakteristische genetische Merkmale des Individuums.

LK-Biochemie Praktikum 2017

© FB 12 / WWU
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