Methoden

Komponenten eines Massenspektrometers
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Für alle Komponenten gibt es verschiedene technische Möglichkeiten. Es sind jedoch nicht alle Kombinationen möglich.

Welche Kombination am sinnvollsten ist, richtet sich nach der Probe und der Fragestellung.
(Diese Aufstellung erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit sondern orientiert sich daran, welche Methoden in dieser Abteilung aktuell eingesetzt werden - es gibt mehr als hier gezeigt werden kann!)

  • Probeneinlass

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    Schubstangen-Einlass

    Tiegel- oder Direkteinlass: Die Probe wird in einen sehr keinen Aluminiumtiegel gegeben und mit einer Schubstange in das Hochvakuum des Massenspektrometers eingeschleust. Dort kann sie bei bis zu 400°C verdampft werden.
    Bei diesem Vorgang kann man unterschiedlich flüchtige Komponenten voneinander trennen.

    Ionisierung: EI oder CI

    © Dr. M. Letzel

    Gaschromatographie

    Gaschromatograph: Die Probe wird in einem Gaschromatographen in ihre Komponenten getrennt. Die Trennsäule endet direkt in der Ionenquelle. Geeignet für alle Gemische, die GC-gängig sind.

    Ionisierung: EI oder CI

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    Schleifeneinlass

    Schleifeneinlass: 1..20µl der gelösten Probe wird in eine Probenschleife gegeben, dann wird mit einem Flüssigkeitsstrom (ca. 50µl/min) die Probe zum ESI-Massenspektrometer gefördert. Es erfolgt keine Trennung.

    Ionisierung: ESI, APCI

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    Spritzeneinlass

    Spritzeneinlass: 10..100µl der gelösten Probe wird auf eine Spritze aufgezogen. Über eine Spritzenpumpe wird ein konstanter Volumenstrom in die Ionenquelle gepumpt und dort versprüht. Es erfolgt keine Trennung.

    Ionisierung: ESI, APCI

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    Flüssigchromatographie (z.B. HPLC)

    Flüssigchromatograph, HPLC: Die Probe wird durch die Chromatographie getrennt und nach dem Durchlauf durch  einen UV-Detektor zum Massenspektrometer geleitet. Sehr gut geeignet für die Untersuchung polarer und mittelpolarer Verbindungen.

    Ionisierung: ESI, APCI

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    Nanospray Einlass

    Nanosprayeinlass: 10µl der gelösten Probe wird in eine Glaskapillare gegeben. Die Lösung wird mit einem eingeführten Draht auf ca. 1kV aufgeladen. Unter dem Einfluss des starken elektrischen Feldes an der Kapillarspitze versprüht die Lösung. Es erfolgt keine Trennung.

    Ionisierung: ESI

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    MALDI Probenträger

    Matrixpräparation: Die Probe wird im Verhältnis 1:50.. 1:10000 mit einer Matrix (z.B. 2,5 Dihydroxybenzoesäure) auf dem Probenträger kokristallisiert. Dieser wird ins Hochvakuum eingeschleust. Die Ionisierung erfolgt durch  Laserpulse.

    Ionisierung: MALDI, LDI (wenn man ohne Matrix arbeitet)

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    Dünnschichtchromatographie, TLC-MS

    Dünnschichtchromatographie, TLC-MS: Die Probe wird auf einer Dünnschichtplatte in ihre Komponenten getrennt. Nach der Lokalisierung der Substanzflecken werden diese mit einem Extraktor eluiert. Das Eluat kann direkt zum MS geleitet werden.

    Ionisierung: ESI oder APCI

    Informationen zum Verfahren als Poster: DGMS-HL.pdf

  • Ionenquelle

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    Ionenquelle EI

     

    Elekronenionisation (veraltet: Elektronenstoßionisation) EI: Die Moleküle werden im Hochvakuum durch Beschuss mit Elektronen (70 eV) ionisiert. Es entstehen überwiegend Radikalkationen. Zusätzlich zu den für die Ionisation notwendigen 6-11eV werden 2-10eV Überschussenergie übertragen. Das führt zu einer mehr oder weniger starken Fragmentierung, die sehr spezifisch für die entsprechende Verbindung ist. Datenbanksuchen sind daher gut möglich.
    Alle Moleküle (soweit unzersetzt verdampfbar) können so ionisiert werden, die Methode ist „unspezifisch“.

     

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    Ionenquelle ESI

    Elektrosprayionisation, ESI oder ES: Die Probe wird gelöst. Die Lösung muss eine gewisse elektrische Leitfähigkeit besitzen. Bevorzugt sind Wasser, Methanol, Acetonitril  ggfs. unter Zusatz von apolaren Lösungsmitteln (CHCl3, CH2Cl2…). In der Lösung bilden sich geladene Teilchen. Positive Ionen durch Anlagerung von Kationen (H+, Na+, NH4+…). Negative Ionen durch Abspaltung von Protonen oder Anlagerung von Anionen (Cl-, HCOO-, Acetat..). Die Ionenbildung kann man durch Zugabe von Salzen oder durch pH-Wertänderung unterstützen. Die so in Lösung gebildeten Ionen werden bei Atmosphärendruck durch Versprühen in einem elektrischen Feld vom Lösungsmittel abgetrennt. Anschließend erfolgt der Transport dieser Ionen in den Massenanalysator.

     

    Positive Ionen Negative Ionen
    [M + H]+ [M - H]-
    [M + NH4]+ [M + Cl]-
    [M + Na]+ [M + HCOO]-
    [M + K]+  

     


    Es bilden sich, abhängig von der Chemie der Probe, auch mehrfach geladene Teilchen oder Zusammenlagerungen von Molekülen.

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    Ionenquelle MALDI

    Laserionisation, s. auch Matrixpräparation (-> Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization): Die Probe wird mit einem sehr kurzen Laserpuls ins Hochvakuum verdampft. Dabei entstehen positive und negative Ionen. Es wird meist ein Stickstofflaser mit 337nm Wellenlänge und 3ns Pulslänge verwendet. Die Bestrahlungsstärke liegt zwischen 0.5 bis 5 MW/cm2.

     

    Positive Ionen Negative Ionen
    [M + H]+ [M - H]-
    [M + NH4]+ [M + Cl]-
    [M + Na]+ [M + HCOO]-
    [M + K]+  

     

    Im Gegensatz zur ESI bilden sich bei MALDI bevorzugt einfach geladene Teilchen. Diese Ionisationsmethode wird meist in Kombination mit einem Flugzeitanalysator eingesetzt.

  • Massenanalysator

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    Flugzeit-Analysator

    Flugzeitmassenspektrometer TOF: Dieser Analysator wird gerne für Ionenquellen eingesetzt, bei denen die Ionenproduktion pulsartig erfolgt. Die Ionen werden auf einer kurzen Strecke durch ein elektrisches Feld beschleunigt (10-20kV) und durchfliegen dann eine feldfreie Strecke. Die Flugzeit ist mit m/z korreliert. Zur Verbesserung der Massenauflösung kann man die Beschleunigungsspannung verzögert einschalten (DE –delayed extraction). Zur Verlängerung der Flugbahn und zur Korrektur von Bildfehlern kann auch ein Reflektor eingesetzt werden.

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    Orthogonaler Flugzeitanalysator

    Orthogonaler Flugzeitanalysator, oTOF: Wenn man ein Flugzeitmassenspektrometer einsetzen will, die Ionen aber kontinuierlich erzeugt werden, setzt man diese Anordnung ein. Die Extraktion der Ionenpakete erfolgt senkrecht zur ursprünglichen Ionenbahn. Damit wird die Massenbestimmung unabhängig von der ursprünglichen Ionenbewegung. Man erreicht mit diesen Geräten eine hohe Massengenauigkeit.

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    Quadrupol Analysator

    Linearer Quadrupol Analysator: In diesem Analysator werden die Ionen, die sich langsam vorwärts bewegen, durch ein elektrisches Wechselfeld zwischen vier parallelen Stäben zu Pendelbewegungen gezwungen. Je nach Wahl der Parameter passieren alle Ionen (rf-only Mode) oder nur Ionen eines schmalen Massenbereichs die Stäbe. Das Auflösungsvermögen eines solchen „Massenfilters“ ist auf ca. 1/4 Da Peakbreite begrenzt.

    Solche Analysatoren können hintereinander geschaltet werden. Eine (bei Bedarf) gasgefüllte Kammer zwischen ihnen ermöglicht MS-MS Experimente (Triple Quad MS).

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    Lineare Ionenfalle

    Lineare Ionenfalle: In diesem Analysator werden die Ionen in einer Quadrupolstruktur durch ein elektrisches Wechselfeld und durch Sperrpotentiale an den Enden festgehalten. Die Ionen können durch einen Scan der Quadrupolspannungen nach m/z geordnet auf seitlich außerhalb angebrachte Detektoren gelenkt werden (Instabilitätsscan).
    Innerhalb einer solchen Falle sind (zeitlich hintereinander) mehrstufige MS-MS Experimente möglich.
    Bei dem vorliegenden Ionanfallengerät (LTQ Orbitrap XL) die Ionen entweder zu den (destruktiven) Detektoren oder zu einer akkurateren Massenanalyse in die Orbitrap weiterleiten.

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    Orbitrap Analysator

    Orbitrap: Dieses sehr neue Analysatorprinzip bietet eine sehr hohe Massenauflösung (100.000) und Massengenauigkeit (besser als 0.002 u). Im vorhandenen Gerät ist die Orbitrap hinter ein Massenspektrometer mit linearer Ionenfalle geschaltet.
    Bei diesem Analysator pendelt ein Ring von Ionen in der Längsachse über einer Zentralelektrode. Die Frequenz dieser Pendelbewegung wird zur Massenbestimmung verwendet.

  • Detektor

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    Sekundärelektronenvervielfacher

    Sekundärelektronenvervielfacher, SEV, SEM: Die Ionen treffen auf eine Konversionsdynode, dort werden durch den Impuls Elektronen gelockert, die von einer um ca. 100V positiveren Elektrode angezogen werden. Dort setzen sie weitere Elektronen frei. Dieser Vorgang wiederholt sich kaskadenartig zwischen zunehmend positiveren Elektroden. Am Ende steht ein hoch verstärktes Signal zur Verfügung. Es gibt etliche Abkömmlinge dieser Detektoren, die jedoch alle nach dem geichen Grundprinzip arbeiten, entweder mit diskreten Stufen oder an Halbleiteroberflächen.

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    Fourier transform MS

    Fourier transform MS: Dieser Ionennachweis wird bei der Orbitrap (und Ionencyclotron Resonanz MS) verwendet. Das Messsignal ist eine Mischung von unterschiedlichen Frequenzen, die den m/z Werten der Ionen entsprechen. Durch eine Fouriertransformation werden die Anteile der einzelnen Frequenzen ermittelt. Weil man Frequenzen sehr genau messen kann, liefert dieses System akkurate Massen bei herausragender Auflösung. Diese Art der Detektion ist für die Ionen "zerstörungsfrei"!

  • Auswertesoftware

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    Auswertesoftware

    Gerätesteuerung/Datenerfassungssoftware: zu den einzelnen Massenspektrometern gibt es spezifische Softwarepakete.

    Compass (Bruker Daltonik GmbH): für AutoFlex Speed (MALDI TOF): Dieses Programmpaket enthält FlexControl (MS-Geräte-Steuerung) und FlexAnalysis (Datenauswertung). FlexImaging ist ein separates Tool zur Auswertung und Visualisierung von MALDI-Imaging Experimenten.

    Compass (Bruker Daltonik GmbH): für MicroTof. Dieses Programmpaket enthält die Teile Hystar (HPLC-Steuerung), MicroTof-Control (MS-Geräte-Steuerung) und DataAnalysis (Datenauswertung).

    MassLynx (Waters, ehem. Micromass): Zur Steuerung und Auswertung für Quattro LCZ, Quattro Micro GC.

    Xcalibur (Thermo Fisher Scientific): Zur Steuerung und Auswertung für TSQ und LTQ Orbitrap XL.

    Chemstation (Agilent): Zur Steuerung und Auswertung für Agilent 6110. Dieses Programm wird nur zur Steuerung und Datenerfassung genutzt, die Abarbeitung erfolgt mit DataAnalysis.

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    Datenformate

    Datenformate: die Datenformate sind proprietär. Es gibt zwar die eine oder andere Exportfunktion, allerdings geht meist durch die Datenumwandlung Information verloren (z.B. die Messbedingungen). Ein Export als ASCII-Textfile führt bei den Geräten mit hoher Massengenauigkeit zu gigantisch großen Datensätzen.
    Für die Verwendung in Publikationen ist es in der Regel am Besten, die Spektren und Chromatogramme mit der Originalsoftware darzustellen und dann als Grafik zu übertragen. Die Mitarbeiter der MS-Abteilung geben gerne über die verschiedenen Möglichkeiten Auskunft.

     

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    Datenbanken

    Vor allem für EI Massenspektren existieren große Sammlungen an Spektren (Datenbanken) von verschiedenen Anbietern, wie NIST, Wiley oder (AIST) SDBS. Meist sind diese Datenbanken in die Auswertesoftware des MS-Datensystems integriert, was eine einfache Suche gemessener Spektren in diesen Datenbanken erlaubt und so eine Identifizierung von Unbekannten ermöglicht. SDBS ist eine japanische Internetdatenbank und frei zugänglich. Auch für MS/MS-Spektren aus ESI- oder MALDI-Messungen sind zunehmend Datenbestände verfügbar, jedoch ist hier die Suche aufgrund weniger guter Reproduzierbarkeit der MS/MS Spektren auf verschiedenen Gerätetypen weniger einfach.

  • Vakuum System

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    Für jedes Massenspektrometer wird spätestens nach der Ionenquelle ein gutes Vakuum benötigt, damit Massenanalysator und Detektor arbeiten können und damit die Ionen die teilweise langen Flugstrecken ohne Ablenkung zurücklegen können. Dazu sind ausgefeilte Pumpsysteme notwendig, die je nach Analysator-System ein Vakuum von bis zu 10-11 mbar erreichen müssen. Dies ist nicht mit einem einstufigen Pumpsystem zu erreichen, so dass oft eine Kombination von Vorvakuum-Pumpe (meist Drehschieberpumpe) und Feinvakuum-Pumpe (Turbomolekular- oder Öldiffusions-Pumpe) eingesetzt wird.

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    Vorvakuumpumpe

    Eine Drehschieberpumpe ist eine Verdrängerpumpe, in unserem Fall für Gase. Sie besteht aus einem Hohlzylinder (Stator), in dem ein weiterer Zylinder (Rotor) exzentrisch rotiert. Der Rotor berührt die Innenwand des Stators zwischen Einlass- und Auslassöffnung. Diese Stelle ist die Trennstelle zwischen Saug- und Druckraum. Vakuumpumpen nach diesem Prinzip werden in auch Ölpumpen genannt, weil sie zum Betrieb größere Mengen Schmieröl benötigen. In der Massenspektrometrie eingesetzte Drehschieberpumpen besitzen meist zwei hintereinander geschaltete Pumpstufen, um ein besseres Endvakuum von ca. 10-4 mbar zu erreichen.

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    Turbomolekularpumpe

    Die Turbomolekularpumpe arbeitet wie eine Flugzeugturbine mit schnell rotierenden Schaufelblättern. Gasteilchen erhalten beim Auftreffen auf die schräg gestellten Blätter einen Impuls in Richtung Vorvakuumpumpe und können so aus dem Rezipienten entfernt werden. Um diesen Vorgang effizient zu gestalten, besteht die Pumpe aus einem Satz von mehreren Schaufelblättern, die mit einer Geschwindigkeit von bis zu 90.000 U/min rotieren.
    Turbomolekularpumpen benötigen einen Vorvakuumdruck von ca. 0.1 mbar; sie erreichen Enddrücke bis ca. 10−10 mbar.

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    Öldiffusionspumpe

    Die Pumpe besteht aus einem zylindrischen Pumpenkörper. Der Boden des Pumpenkörpers enthält eine Heizplatte, die das darüber liegende Diffusionspumpenöl aufheizt. Im Siederaum steht ein Düsensystem, durch welches das erhitzte Öl mit hohem Druck versprüht wird. An den gekühlten Wänden kondensiert das Öl und wird zurückgeführt. Gasmoleküle, die in den Dampfstrahl gelangen, werden mitgerissen und nach unten in einen Bereich höheren Druckes gefördert. Dort befindet sich als Ausgang aus der Diffusionspumpe der Vorvakuumstutzen. Durch das Heizen des Treibmittels treten die gefangenen Moleküle wieder aus und werden von der Vorvakuumpumpe abgepumpt. Öldiffusionspumpen benötigen einen Vorvakuumdruck von ca. 0.1 mbar; sie erreichen Enddrücke bis ca. 10−9 mbar, je nach Dampfdruck des Diffusionspumpenöls.