Quantitative Mikroskopie – Lebenszeitmessungen und Kraftsensor-Multiplexverfahren

 

FRET Signale lassen sich mit Hilfe unterschiedlicher Mikroskopieverfahren analysieren (Cost et al. 2015). Nur wenige Techniken, wie zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung-Fluoreszenz-Lebenszeitmikroskopie (TCSPC-FLIM), erlauben jedoch die quantitative Bestimmung der FRET Effizienz, welche für die Berechnung von molekularen Kräften bekannt sein muss. Wir haben daher Mikroskopie-Methoden und Software entwickelt, mit denen sich unsere Lebendzell TCSPC-FLIM Daten effizient evaluieren lassen (Austen et al. 2011). In Kombination mit unserem FL-Modul und bi-exponentiellem Fitten der Lebenszeitabfälle, kann FLIM auch verwendet werden, um den Anteil von mechanisch eingebundenen Molekülen einer Protein-Population zu bestimmen.
Darüber hinaus haben wir ein sogenanntes Kraftsensor-Multiplexverfahren entwickelt, mit dem sich zwei Kraftsensoren, die in einer Zelle exprimiert sind, simultan analysieren lassen. Durch Anpassung der Exzitations- und Emissionsspektren haben wir zwei orthogonale Biosensoren generiert, die mit der gleichen Wellenlänge (440nm) angeregt aber in unterschiedlichen Emissionsfenster ausgewertet werden können. So ist es möglich, zwei FLIM Signale, die der gleichen Zelle (und sogar der gleichen subzellulären Struktur) entstammen, quantitativ zu analysieren (Ringer et al. 2017). Wir haben diese Methode bereits erfolgreich verwendet, um Mechanismen der molekularen Kraftübertragung entlang des essentiellen Zelladhäsionsmoleküls Talin-1 zu untersuchen.

© Uni MS - Prof. Dr. C. Grashoff

 


 
Ausgewählte Veröffentlichungen zum Thema:

Austen K, Kluger C, Freikamp A, Chrostek-Grashoff A, Grashoff C. Methods Mol Biol. 2013; 1066:169-184. >>

Cost AL, Ringer P, Chrostek-Grashoff A, Grashoff C. Cell Mol Bioeng. 2015; 8(1):96-105. [Epub 2014 Dec 2] >>

Ringer P, Weißl A, Cost AL, Freikamp A, Sabass B, Mehlich A, Tramier M, Rief M, Grashoff C. Nature Methods 2017 Nov; 14(11):1090-1096. [Epub 2017 Sep 18]. >>