Signaltransduktionsmechanismen in der Gefäßwand
Mechanismen der von-Willebrand-Faktor- und Plasminogenaktivator-Freisetzung aus aktivierten Endothelzellen
Von-Willebrand-Faktor (vWF) und der Plasminogenaktivator tPA (tissue-type plasminogen activator) greifen in unterschiedlicher Weise in das fibrinolytische Geschehen
im Gefäß ein. Während vWF Koagulation, Plättchenaggregation und Plättchenadhäsion fördert, wirkt tPA diesen Prozessen
entgegen. Eine regulierte Freisetzung der beiden Faktoren in die Vaskulatur ist somit eine physiologische Notwendigkeit, die in erster Linie durch die vaskulären
Endothelzellen gewährleistet wird. vWF und tPA (bzw. deren Vorläufer) werden in den Endothelzellen synthetisiert, in distinkten Sekretgranula gespeichert
und über konstitutive wie auch regulierte Exozytose abgegeben. Die regulierte Freisetzung kann hierbei durch Stimulantien wie Histamin oder Thrombin induziert
werden, die transiente Erhöhungen im freien Ca2+-Spiegel hervorrufen. Allerdings scheinen signifikante Unterschiede in der intraendothelialen
Ca2+-Signaltransduktion zu existieren, die der vWF- bzw. tPA-Freisetzung vorangeht. Es ist demzufolge wahrscheinlich (und auch physiologisch sinnvoll), daß die
regulierte Freisetzung der beiden Proteine nach gegebenem Stimulus in unterschiedlicher Weise angesteuert werden kann, d.h. eine abgestufte Ca2+-regulierte Exozytose
der jeweiligen Speichergranula erfolgt. Basierend auf diesen Beobachtungen wollten wir im vorgestellten Projekt physiologisch relevante Unterschiede in der vWF- und
tPA-Sekretion charakterisieren und die beteiligten Granula sowie für die Prozesse relevante zytosolische Faktoren vergleichen bzw. beschreiben.
Geplant war, Unterschiede in
der akuten und Ca2+-regulierte Exozytose von vWF und tPA aus humanen kultivierten Endothelzellen (HUVEC) durch Bestimmung der jeweils freigesetzten Menge beider
Faktoren sowie Antikörperaufnahmestudien zu ermitteln. In diesen Experimenten sollten die Endothelzellen durch Stimulantien wie Histamin bzw. direkte
Erhöhung des intraendothelialen Ca2+-Spiegels mittels Ca2+-Ionophor zur akuten Sekretion stimuliert werden. Anschließend sollte insbesondere die
Höhe und Kinetik der akuten vWF- und tPA-Freisetzung nach einem gegebenen Stimulans ermittelt werden. In einem zweiten Schwerpunkt wollten wir
Aufschlüsse zum Mechanismus der jeweiligen regulierten Exozytose durch Einsatz bekannter Modulatoren (inhibitorischer wie stimulierender) exozytotischer
Prozesse erlangen. Hier hatten wir zum einen an inhibitorische Annexin-Peptide gedacht, für die wir in vorherigen Experimenten an endothelialen Einzelzellen eine
spezifische inhibitorische Wirkung auf die globale Ca2+-regulierte Exozytose nachweisen konnten. Daneben sollte untersucht werden, ob und wie Modulatoren der
SNARE-vermittelten Membranfusion die Freisetzung von vWF bzw. tPA aus den stimulierten Endothelzellen beeinflussen. In diesem Zusammenhang sollten insbesondere
dominant negative Mutanten kleiner GTPase (Rab3, Rab4) zum Einsatz kommen. Schließlich wollten wir zelluläre Proteine, die spezifisch für die vWF-
bzw. tPA Speichergranula sind, identifizieren und charakterisieren.
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