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Forschungsschwerpunkte 2003 - 2004    zurück    weiter

Signaltransduktionsmechanismen in der Gefäßwand Identifizierung Aldosteron-induzierter "early genes" mittels Atomic Force Mikroskopie in Endothelzellen   Steroidhormone diffundieren als lipophile Moleküle problemlos durch Plasmamembranen, finden in ihren Zielzellen entsprechende Rezeptoren und führen zu deren Aktivierung und Translokation in den Zellkern. Dadurch werden spezifische Transkriptionsprozesse ausgelöst. Die Hormon-spezifischen Transkripte verlassen den Zellkern und werden an den Ribosomen in Proteine translatiert, welche in der Folge eine Funktionsänderung in der jeweiligen Zelle einleiten. Dieser genomischen Antwort läuft eine schnelle, nicht genomische Antwort voraus, die offensichtlich den Zellkern zu einer Hormon-bedingten Funktionsänderung vorbereitet. Das Mineralokortikoidhormon Aldosteron löst unter anderem in Endothelzellen eine sekundenschnelle Erhöhung des intrazellulären Calciums aus, gefolgt von minutenlanger Alkalinisierung und transienter Zellkernschwellung. In jüngsten Experimenten stellten wir fest, dass bereits Minuten nach Aldosteron-Injektion in Xenopus laevis Oozyten (Modellzelle) ca. 800 kDa grosse Makromoleküle (plugs) durch die Kernporenkomplexe den Zellkern verlassen. Diese in der zellbiologischen Literatur als plugs bezeichneten Strukturen (vermutlich Ribonucleoproteine) sitzen im zentralen Kanal einzelner Kernporen, welche die funktionelle Verbindung zwischen Nucleoplasma und Cytosol einer Zelle bilden. Wir entwickelten Techniken, um in nativen Kernhüllen mittels Atomic Force Mikroskopie (AFM) einzelne Kernporen (Durchmesser: 100 nm) mit plugs (Durchmesser etwa 40 nm) zu visualisieren und nanochirurgisch mit der AFM-Tastspitze abzuernten ("plug-harvesting"). Mit molekularbiologischen Methoden (RNA-Isolation von der AFM-Tastspitze und RT-PCR) möchten wir die im plug enthaltene mRNA identifizieren. Parallel dazu wird eine neu-entwickelte elektrophysiologische Technik (Strommessung durch Kernporen mittels der "Nuclear hourglass-Methode) mit dem Ziel eingesetzt, den Aldosteron-induzierten RNA-Export in seiner zeitlichen Kinetik zu erfassen. Das elektrische RNA-Export Assay fusst auf der Beobachtung dass der Transport grosser Makromoleküle den Ionenstrom durch den zentralen Kernporenkanal messbar blockiert. Da die Kernporen in ihrer Transportaktivität durch Calcium, pH-Wert, ATP und weitere noch unbekannte Faktoren reguliert werden, möchten wir die Signalkaskade untersuchen, welche den Export der mRNA aus dem Kern steuert. Dazu werden entsprechende Blocker/Aktivatoren in die Hormon-stimulierte Zelle injiziert, woraufhin der mRNA Export mittels elektrophysiologischer Methoden und der AFM-Technik verfolgt wird. Die Experimente werden wegen der besseren Handhabung zuerst im Oozytenmodell entwickelt und nach experimenteller Optimierung an humanen Endothelzellen (HUVEC) fortgesetzt. Zwei Ziele charakterisieren dieses Projekt: Die Identifizierung jener Gene, welche am Anfang der genomischen Antwort auf Aldosteron stehen. Die Erforschung der Regulationsmechanismen an der Kernpore, die den mRNA-Export steuern. Die Ergebnisse sollen klinische Perspektiven zur Aldosteron-gesteuerten Endothelfunktion eröffnen. Drittmittelgeber: Bundesminister für Bildung, Forschung und Technologie + IZKF Münster Beteiligter Wissenschaftler: Univ.-Prof. Dr. med. Hans Oberleithner Veröffentlichungen: Shahin V, Danker T, Enss K, Ossig R and Oberleithner H (2001). Evidence for Ca2+- and ATP-sensitive peripheral channels in nuclear pore complexes. FASEB J 15: 1895-1901 [IF 7.1] Danker T, Shahin V, Schlune A, Schafer C and Oberleithner H (2001). Electrophoretic plugging of nuclear pores by using the nuclear hourglass technique. J Membr Biol 184: 91-99.[IF 2.4] Schäfer C, Shahin V, Albermann L, Hug MJ, Reinhardt J, Schillers H, Schneider SW, Oberleithner H (2002). Aldosterone pathway across nuclear envelope. Proc Natl Acad Sci USA 99, 7154-7159. [IF10.5] Schäfer C, Shahin V, Albermann L, Schillers H, Hug MJ, Oberleithner H (2003). Intracellular calcium:a prerequisite for aldosterone action. J Membrane Biol 196:157-162 [2.4] Oberleithner H, Schäfer C, Shahin V, Albermann L (2003). Route of steroid-activated macromolecules through nuclear pores imaged with atomic force microscopy. Biochem Soc Trans 31:71-75 [2.3] Enss K, Danker T, Schlune A, Buchholz I, Oberleithner H (2003). Passive Transport of macromolecules through Xenopus laevis nuclear envelope. J Membrane Biol 196:147-155. [IF2.4] Oberleithner H, Schneider SW, Albermann L, Hillebrand U, Ludwig T, Riethmüller C, Shahin V, Schäfer C, Schillers H (2003). Endothelial cell swelling by aldosterone J Membrane Biol 196:163-172 [IF 2.4] Oberleithner H, Ludwig T, Riethmuller C, Hillebrand U, Albermann L, Schafer C, Shahin V and Schillers H (2004). Human endothelium: target for aldosterone. Hypertension 43: 952-956. [IF 5.1] Buchholz I, Enss K, Schafer C, Schlune A, Shahin V, Oberleithner H (2004). Transient permeability leak of nuclear envelope induced by aldosterone. J Membrane Biol 199:135-141 [IF 2.4]