Experimentelle Tumorbiologie
Funktion der Rab GTPasen beim zellulären Transport
Die GTPasen der Rab/Ypt - Familie stellen die weitaus größte Gruppe der ras
Superfamilie dar. In über 30% aller humanen Tumoren sind ras Proteine in aktivierter,
punktmutierter Form zu finden.
Rab1
Rab1a und Rab1b Proteine zeigen eine Lokalisation im Bereich des cis-Golgi-Apparates und scheinen in
Transportvorgänge des ersten Schrittes des exozytotischen Weges regulativ involviert zu sein. Durch den
Einsatz verschiedener Rab Mutanten im "yeast two hybrid" - System haben wir neue Interaktionspartner
identifiziert und analysieren derzeit die funktionelle Bedeutung der Interaktion, der jeweiligen Proteine. So ist
es uns gelungen GM130, Iporin und die Mical Proteine als spezifische Interaktionspartner von Rab1 zu
identifizieren und die Bindungsdomänen zu lokalisieren. Die Aspekte zur intrazellulären
Lokalisation bearbeiten wir mit Hilfe von Zellfraktionierungstechniken und Immunfluoreszenzanalysen. In
vivo Experimente mit GFP-markierten Rab1b GTPasen und Effektoren werden ebenfalls
durchgeführt. Detaillierte Strukturanalysen werden in Kooperation mit dem MPI Dortmund bearbeitet.
Rab6
Rab6 ist ebenfalls ein Mitglied der Rab/Ypt - Familie und reguliert intrazelluläre
Golgi-Transportprozesse. Mit Hilfe eines "yeast two hybrid screens" konnten wir das Dynein/Dynactin -
Bindungsprotein Bicaudal D1 (BICD1) und eine Reihe weiterer Proteine als Rab6 Interaktionspartner
identifizieren. Die Analysen ergaben, dass diese Interaktionen Rab6-spezifisch und meist
Nukleotid-abhängig sind. Nach Lokalisation der Interaktionsdomänen durch Konstruktion
zahlreicher Deletionsmutanten und Chimären, liegt der Schwerpunkt unserer Untersuchungen derzeit auf
der zellulären Lokalisation sowie Studien zur funktionellen Analyse der Interaktionspartner.
Rab11 und seine Rolle im sekretorischen Transportweg
Rab11 befindet sich an “recycling“ Endosomen,
dem TGN, und sekretorischen Vesikeln. Erst kürzlich wurden einige Interaktionspartner von Rab11
beschrieben. So konnte gezeigt werden, dass Rab11 mit MyosinVb interagiert und so den Myosinmotor an
Transferrinrezeptorhaltige Transportvesikel anheftet. Dennoch ist der genaue Mechanismus, wie Rab11
Proteine die endozytotischen Transportprozesse regulieren bislang noch unklar. Mit “primern“ die
2 von 4 hochkonservierten Sequenzen entsprechen, welche für die GTP-Bindung kleiner ras-verwandter
GTPasen in der Hefe essentiell sind, wurde eine “sub-library“ von PCR Produkten generiert, die
die Effektorregion dieser GTPasen repräsentiert. Ein Klon, der einem Fragment des Hefechromosoms
VII entspricht, konnte als neue GTPase mit 70% Homologie zu Rab11 identifiziert werden und wurde mit
Ypt11 bezeichnet. Da ein Ypt11 “knock out“ in der Hefe keine eindeutigen Defekte erkennen
ließ und subzelluläre Lokalisationsstudien mit entsprechend markierten Ypt11/Rab11 Proteinen in
der Säugerzelle präziser zu verfolgen sind, haben wir inzwischen GFP-markierte Konstrukte des
Ypt11 Gens hergestellt und deren Expression in Säugerzellen mit Fluoreszenz- und konfokaler
Laserscanningmikroskopie untersucht. In Ko-Lokalisationsstudien mit CFP-markiertem Rab11 und
Rhodamin-markiertem Transferrin konnten wir nachweisen, dass transfiziertes Ypt11-GFP in
Säugerzellen ebenfalls den “recycling“ Endosomen zugeführt wird. Weiterhin haben
wir Ypt11GFP und Rab11CFP Mutanten hergestellt, die nicht mehr in der Lage sind, GTP zu binden. Nach
Expression in Säugerzellen sind beide mutierte Proteine nicht mehr an endosomalen Kompartimenten
lokalisiert, sondern verbleiben im Zytoplasma. Mit neuer Methodik werden wir der Frage nachgehen, welche
Faktoren für die identische Lokalisation der beiden GTPasen Rab11 und Ypt11 in der Säugerzelle
verantwortlich sind. Da beide Proteine nur eine eingeschränkte Homologie zeigen, gehen wir davon aus,
das dass korrekte “targeting“ von bislang unbekannten Effektoren/Regulatoren gesteuert wird.
Drittmittelgeber:
Beteiligte Wissenschaftler:
Veröffentlichungen:
|
