Regeneration und Plastizität im Nervensystem
Molekulare Mechanismen der axonalen Regeneration in transgenen Tieren
Das erste Ziel des Vorhabens war die Optimierung von Kultivierungs- und Neuroprotektionsmaßnahmen, um eine erfolgreiche Regeneration von
Axonen aus verschiedenen Tieren und vor allem transgenen Tieren zu erhalten. Als quantitative Parameter stellten sich zum einen die Zahl regenerierender Axone pro
retinales Explantat und zum anderen die Wachstumsgeschwindigkeit unter den gewählten Bedingungen heraus. Die Wachstumsgeschwindigkeit wurde mittels
Zeitraffertechnik ermittelt und erwies sich als äußerst sensitiv.
Das zweite Ziel war die proteomische Analyse der regenerierenden Retinaexplantate. Durch MALDI-MS Analyse von 2D-aufgetrenten Spots konnten wir zum
einen eine proteomische Karte der Retina der Ratte und des Affen aufstellen. Zum anderen konnten wir regenerationsspezifisch expimierte Spots identifizieren (a-crystallin,
calmodullin, fatty-acid-binding protein), deren funktionelle Rolle im in vitro Explantationsassay gestestet wurde. Die Charakterisierung von wachstumsassoziierten
Proteinen (GAPs) und insbesondere von GAP-43 ergaben, dass bei Nagetieren (Mäuse, Ratten) das Protein in der postnatalen Phase herunterreguliert wird und erst
nach einer Sehnervenverletzung oder nach einer Linsenverletzung wieder innerhalb von 24 Stunden hochreguliert wird. Das Molekül wird ebenfalls während
der Regeneration von Axonen in den Wachstumskegeln akkumuliert und scheint eine entscheidende Triggerfunktion für die Bildung von Wachstumskegeln zu
haben. Vergleiche zwischen verschiedenen Spezies (Maus, Hühnchen, Ratte, Affe) ergaben, dass diejenigen Spezies, die eine konstitutive Hochregulation von
GAP-43 haben (Hühnchen, Affe) eine bessere axonale Regeneration aufweisen als Spezies, bei den das GAP-43 erst hochreguliert werden muss (Ratte, Maus). Diese
Schlüsselfunktion von GAP-43 sowie Modifikationen des Moleküls (Phosphorylisierung) wurden im Rahmen des Projektes weiter untersucht. Die initiale
Bildung eines Wachstumskegels als Voraussetzung für Regeneration findet nur auf dem Extrazellulärmatrixprotein Laminin-1 statt. Es wurden deshalb die
lamininbindenden Integrine (alpha6beta1) charakterisiert. Alpha6 wird sehr schnell nach dem Kontakt des Explantates mit Laminin exprimiert, während
Antikörper gegen das Molekül das axonale Wachstum blockieren und die Fasern zur Desintegration zwingen. Dieser Effekt ist verstärkt durch die
Zugabe von Anti-beta-1-Antikörpern. Kontrollen mit Antikörpern gegen das nichtneuronale alpha5 Integrin zeigten keine Effekte. Diese Versuche, die
ebenfalls mit Zeitrafferaufnahmen durchgeführt wurden, weisen auf die essentielle Rolle von spezifischen Rezeptoren für die axonale Elongation hin.
Das dritte Ziel war die Identifizierung von regenerationsspezifischen Proteinen in 2D-Gelen und anschließenden Sequenzierung. Aus der kartierten Retina
der Ratte und des Affen wurden kalziumregulierende Proteine identifiziert, deren Rolle bei der axonalen Regeneration weiter untersucht wird. Insbesondere wird auf dem
Transkriptionsfaktor HMGB-1 hingewiesen, der bei der Regeneration herunterreguliert wird. Durch Immunhistochemie konnte HMGB-1 in den Ganglienzellen lokalisiert
werden. Somit konnte nachgewiesen werden, dass für die axonale Regeneration sowohl Rezeptoren für Extrazellulärmatrixproteine, als auch
Überlebensfaktoren, als auch Transkriptionsfaktoren essentiell sind. Die Projekte wurden planmäßig innerhalb der Förderphase abgeschlossen.
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