Neurogene Entzündung:
Bedeutung von Protease-aktivierten Rezeptoren

Der erst seit kurzem bekannte Proteinase-aktivierte Rezeptor-2 (PAR-2) steht wegen seiner hochwahrscheinlichen Bedeutung bei entzündlichen Erkrankungen im Mittelpunkt meiner Untersuchungen. Im zurückliegenden Jahr konnten neue Erkenntnisse über die Bedeutung von PAR-2 bei der kutanen Entzündung herausgearbeitet werden. So konnten wir auf Proteinebene (ELISA, FACS) und RNA-Ebene (semiquantitative RT PCR, Northern blot) aufzeigen, dass PAR-2 Agonisten (10^-7 - 10^-9 M) die Freisetzung von proinflammatorischen Cytokinen (Interleukin-6, ca. 4-fach; Interleukin-8, ca. 2,5-fach) und Zelladhäsionsmolekülen (ICAM-1, E-Selektin) in primären humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMEC) spezifisch aufregulieren. Die PAR-2 mediierte Aufregulation von ICAM-1 scheint dabei durch NF-kB reguliert zu werden. Dies lässt sich durch die Beobachtung belegen, dass Inhibitoren für NF-kB Aktivierung zu einer Blockade der ICAM-1 Aufregulation durch PAR-2 Agonisten zu führen. Im Supershift konnte weiter belegt werden, dass dieser Effekt dem Heterodimer p50/p65 im NF-kB Komplex zugeschrieben werden kann. Im Moment generieren wir deshalb Deletionsmutanten für ICAM-1 und E-Selektin, die stabil in Keratinozyten bzw. dermale Endothelzellen transfiziert werden, um die Spezifität der PAR-2 induzierten NF-kB abhängigen ICAM Regulation zu verifizieren.
In einem weiteren Projekt wird der Mechanismus der Inaktivierung des PAR2 Rezeptors untersucht. Das Verständnis der Rezeptorinaktivierung ist von hoher zellbiologischer und pharmakologischer Relevanz, da sich hierdurch neue Ansatzpunkte für eine spezifische Therapie bei entzündlichen Erkrankungen ergeben können, in denen Serinproteasen und PAR2 involviert sind. Durch in-vitro Mutagenese werden stabile Zellinien erarbeitet, denen ein Di-leucin im intrazellulären C-Terminus von PAR2 fehlen (L259-L260-C261-). Dieses Motiv spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle für das lysosomale trafficking von PAR-2. So konnten wir bereits funktionelle Mutanten generieren, die jetzt mit Hilfe der konfokalen Laser-Scan Mikroskopie, der FACS Analyse und Signaltransduktionskaskade-Analyse näher charakterisiert werden können.
Weitere Untersuchungen hatten zum Ziel, die Bedeutung von PAR-2 für die Immunregulation humaner Mastzellen zu verstehen. So konnte die Expression von PAR-2 auf primären humanen Mastzellen und HMC-1 Zellen gefunden werden. Diese Beobachtung legt einen autokrinen Regulationsmechanismus von Mastzellen durch Tryptase über PAR-2 nahe. Diese Hypothese wird im Moment mit molekularbiologischen, immunologischen, biochemischen und immunhistochemischen Methoden untersucht.