Teilprojekt B1 (Grabbe/Schwarz): Untersuchungen zur Aufklärung der Effektormechanismen der allergischen Kontaktdermatitis

Projektleiter:	PD Dr. med. Stepan Grabbe, Prof. Dr. med. Thomas Schwarz
Dienstanschrift:	Universitäts-Hautklinik Münster Von-Esmarch-Str. 56 48149 Münster
Telefon:	(0251)835 8599
Telefax:	(0251) 835 8579
E-Mail:	grabbe@uni-muenster.de, schwtho@uni-muenster.de

Das langfristig ausgelegte Ziel des vorliegenden Projekts ist die Untersuchung der Pathophysiologie der Auslösephase des allergischen Kontaktekzems. Hierbei bilden vor allem die Signale, die zur Auslösung einer Ekzemreaktion führen und die daran beteiligten zellulären Elemente den Mittelpunkt unseres Interesses. In der zurückliegenden Antragsperiode konnten mehrere wichtige Erkenntnisse hierzu gewonnen werden, die z.T. bereits publiziert wurden (u.a. im Journal of Clinical Investigation, Immunology Today, Journal of Immunology, Journal of Experimental Medicine) bzw. deren Ergebnisse in Kürze zur Publikation eingereicht werden können. Viele der im Vorantrag im Detail beschriebenen Experimente wurden wie veranschlagt durchgeführt. Einige der im Erstantrag gewählten Ansätze erwiesen sich jedoch als nicht zielführend. Anstelle dessen konnten - z.T. aufgrund neuer Erkenntnisse, z.T. aufgrund der Verfügbarkeit interessanter neuartiger Untersuchungsmodelle - zusätzliche ersuchsreihen durchgeführt bzw. begonnen werden, die sich als vielversprechend erwiesen und teilweise die Basis für diesen Folgeantrag geschaffen haben. Der erste Arbeitsschwerpunkt des Projekts war die Identifizierung von Faktoren, die neben der eigentlichen immunologischen Erkennung des Allergens zusätzlich erforderlich sind, um eine Kontaktekzemreaktion in adäquater Weise auszulösen. In diesem Zusammenhang konnten wir zeigen, daß die Auslösung des allergischen Kontaktekzems nicht allein durch die Anwesenheit einer für die immunologische Erkennung ausreichenden Dosis eines Antigens bedingt ist (Grabbe 1996). Hierbei verwendeten wir ein Untersuchungsmodell, in dem Mäuse gegen ein ("spezifisches") Hapten sensibilisiert wurden und anschließend das Kontaktekzem durch Applikation einer Kombination verschiedener Konzentrationen spezifischen Haptens zusammen mit einem zweiten, immunologisch irrelevanten Hapten ausgelöst wurde. Durch Applikation des spezifischen Haptens in unterschwelliger Dosierung und gleichzeitige Applikation einer Titrationsreihe eines zweiten, nicht verwandten Haptens konnte demonstriert werden, daß die zusätzliche Verabreichung eines zweiten Haptens in ausreichender Konzentration eine starke Ekzemreaktion bereits gegen sehr geringe, stark unterschwellige Dosierungen des relevanten Haptens verursacht, sodaß also ein immunologisch irrelevantes Hapten zur Auslösung einer spezifischen Immunantwort wesentlich beitragen kann. Hierbei war die Menge des spezifischen Haptens, die zur Auslösung einer Ekzemreaktion in gegen dieses Hapten sensibilisierten Mäusen erforderlich war, im Vergleich zur alleinigen Applikation dieses Haptens etwa 1000mal geringer, wenn gleichzeitig ein nicht verwandtes zweites Hapten mit aufgetragen wurde. Weiterhin zeigte sich, daß im Gegensatz dazu bereits eine minimale Verringerung des durch das zweite Hapten ausgelösten unspezifischen Entzündungsreizes eine stark reduzierte Ekzemreaktion gegen das gleichzeitig in geringer Dosierung aufgetragene spezifische Hapten bewirkte. Wir konnten ausschließen, daß der unspezifisch-proinflammatorische Effekt des irrelevanten Haptens durch eine immunologische Erkennung desselben bedingt ist, da dieser Effekt auch dann noch unvermindert vorhanden war, wenn zuvor eine Immuntoleranz gegen dieses Hapten induziert worden war. Daraus ergibt sich, daß die starke Dosisabhängigkeit des allergischen Kontaktekzems nicht dadurch bedingt ist, daß die zur immunologischen Erkennung erforderliche Antigenmenge limitiert ist, sondern daß eine bestimmte Menge Hapten zur Induktion einer unspezifischen Entzündungsreaktion erforderlich ist. Somit konnten wir zeigen, daß Allergene neben ihrer Eigenschaft, vom Immunsystem spezifisch erkannt zu werden, noch eine zweite Eigenschaft besitzen müssen, nämlich die Fähigkeit, eine bislang nicht näher definierte "Irritation" bzw. Entzündungsreaktion zu verursachen. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, daß diese proinflammatorische Komponente eine grundsätzliche Eigenschaft von Allergenen zu sein scheint, und daß die Art der durch sie ausgelösten unterschwelligen Entzündungsreaktion sich von der durch Irritanzien verursachten Entzündung unterscheidet. Diese Befunde wurden im Journal of Clinical Investigation publiziert. Darüberhinaus wurden zwei Übersichtsartikel hierzu verfaßt, von denen einer (im Am. J. Contact Dermatitis publiziert) direkt die hier beschriebenen Untersuchungen adressierte, und der andere (in Immunology Today publiziert) diese Untersuchungen in einen größeren Zusammenhang stellt und den derzeitigen Stand unseres Wissens zur Pathophysiologie des Kontaktekzems zusammenfaßt. Diese Untersuchungsreihe wurde inzwischen weitergeführt und vertieft. Zum Einen wurde untersucht, ob tolerogene Haptene möglicherweise deswegen eine Immuntoleranz induzieren, weil sie genau die oben beschriebene Fähigkeit zur Induktion einer Entzündungsreaktion nicht besitzen. Hierzu machten wir uns zunutze, daß das Hapten Dinitro-phenol (DNP) zum einen in einer immunogenen Form als Dinitrofluorobenzol (DNFB) und zum anderen in einer tolerogenen Form als Dinitrothiocyanobenzol (DNTB) epikutan appliziert werden kann. Daher wurden Mäuse gegenüber DNFB sensibilisiert, und eine Woche später wurde das Tolerogen DNTB zusammen mit einem irrelevanten Hapten epikutan zur Auslösung eines Kontaktekzems appliziert. Während weder das irrelevante Hapten noch DNTB allein eine Ohrschwellungsreaktion auslösen konnten, führte die Kombination beider Substanzen zu einer starken Ekzemreaktion, die von der durch das Allergen DNFB ausgelösten Reaktion nicht zu unterscheiden war (Abb. 1). Diese Daten bestätigen die Relevanz unserer ursprünglichen Beobachtung und deuten zudem darauf hin, daß eine Substanz möglicherweise genau dann zum Allergen wird, wenn sie die Fähigkeit zur Induktion einer Antigen-unabhängigen Immunaktivierung besitzt. Diese Befunde werden derzeit zur Publikation vorbereitet. Eine zweite Versuchsreihe hatte zum Ziel, die Dissoziation der spezifischen, allergenen und der unspezifischen, inflammatorischen Komponente von Haptenen auch in vitro nachzuvollziehen, da hiermit ein sensitives Testsystem zur Untersuchung eines allergenen Potentials von neuen dermatologischen Substanzen etabliert werden könnte. Der experimentelle Aufbau wurde so gewählt, daß Mäuse mit dem zu testenden Hapten sensibilisiert wurden und anschließend Zellsuspensionen aus regionären Lymphknoten hergestellt wurden, die mit verschiedenen Konzentrationen des spezifischen Haptens in seiner wasserlöslichen Form in vitro stimuliert worden waren. Zusammen mit diesem spezifischen Hapten wurde eine relativ hohe Dosis eines irrelevanten Haptens, gegen das die Maus zuvor nicht sensibilisiert worden war, appliziert, in der Annahme, daß dieses irrelevante Hapten eine nicht haptenspezifische, generelle Aktivierung von T Zellen verursacht und somit die Schwelle, ab derer sich eine Immunantwort gegen die zu testende Substanz zeigt, erniedrigt. Tatsächlich konnte gezeigt werden, daß die gleichzeitige Applikation eines zweiten, irrelevanten Haptens in vitro die spezifische Immunantwort von Lymphknotenzellen aus Hapten-sensibilisierten Mäusen deutlich verstärkt. Diese Untersuchungen legen die Schlußfolgerung nahe, daß die oben beschriebene unspezifische proinflammatorische Eigenschaft von Haptenen zumindest zum Teil eine direkte Aktivierung von T Zellen bedingt und nicht allein über indirekte Mechanismen, z.B. die Freisetzung von Zytokinen aus epidermalen Keratinozyten, gesteuert wird. Allerdings weisen diese in vitro-Experimente noch immer eine nicht unerhebliche Variabilität auf, deren Ursache derzeit noch unbekannt ist. Daher haben diese Daten noch vorläufigen Charakter und müssen im weiteren Verlauf dieses Projektes verifiziert werden. Eine weitere Versuchsreihe hatte die nähere Charakterisierung des durch Haptene verursachten proinflammatorischen Reizes, der zur Auslösung einer Ekzemreaktion so wichtig zu sein scheint, zum Ziel. Während unser ursprüngliches Versuchsprotokoll die gleichzeitige Verabreichung eines spezifischen Haptens in stark unterschwelliger Konzentration, die allein nicht zur Auslösung eines Kontaktekzems ausreicht, zusammen mit einem irrelevanten zweiten Hapten in höherer Konzentration vorsah, wurden nun anstelle des irrelevanten zweiten Haptens verschiedene definierte Substanzen appliziert, von denen eine derartige Wirkung postuliert werden könnte. Es zeigte sich, daß weder die intrakutane Injektion von IL-1alpha, IL-1beta IL-12, TNFalpha, MIP-1alpha noch von GM-CSF zusammen mit dem spezifischen Hapten in unterschwelliger Konzentration eine gleichartige Wirkung wie Applikation eines zweiten Haptens hatte. Dies läßt vermuten, daß der proinflammatorische Effekt von Haptenen nicht durch irgendeine unspezifische Entzündung oder durch die Freisetzung gängiger inflammatorischer Zytokine bedingt ist, sondern daß eine recht spezifische Art der "Entzündung" durch sie verursacht wird, die für die Auslösung des allergischen Kontaktekzems essentiell zu sein scheint. Es muß allerdings offen bleiben, ob die Mediatoren in optimaler Dosierung injiziert wurden. Darüberhinaus kann nicht ausgeschlossen werden, daß eine bestimmte Kombination von Mediatoren notwendig ist, oder daß bislang nicht identifizierte Faktoren diesen Effekt verursachen. Nachdem mehrere Faktoren in dieser Hinsicht untersucht worden waren, ohne daß so die für die Auslösung der Reaktion relevante Substanz identifiziert werden konnte, wurde auf eine breit angelegte Analyse verschiedener für diesen Effekt infrage kommender Faktoren verzichtet, da diese Untersuchungen sonst zu sehr dem Zufallsprinzip unterworfen wären. Anstelle dessen haben wir begonnen, einen alternativen Weg zur Charakterisierung des inflammatorischen Signals einzuschlagen, der auch in der kommenden Förderperiode weiterverfolgt werden soll. Der zweite Arbeitsschwerpunkt dieses Projekts hatte die nähere Charakterisierung der für die Auslösung der allergischen Kontaktdermatitis relevanten Antigen-präsentierenden Zelle (APC) zum Inhalt. Eigene Voruntersuchungen hatten ergeben, daß die epidermalen Langerhanszellen nicht wie zuvor allgemein angenommen für die Auslösung des allergischen Kontaktekzems notwendig sind, sondern daß vielmehr ein Kontaktekzem in vollem Umfang (und sogar in verstärkter Weise) auch in Langerhanszell-depletierter Haut auslösbar ist. Zur Depletion der Langerhanszellen wurden verschiedene Techniken verwendet, von denen die epikutane Steroidapplikation ca. 2 Wochen vor Auslösung des Kontaktekzems die effektivste ist. Wir haben daher zunächst untersucht, ob die für die Auslösung der allergischen Kontaktdermatitis relevanten APC in der Epidermis und/oder in der Dermis lokalisiert sind. Hierzu wurden epidermale bzw. dermale Zellpopulationen von Langerhanszell-depletierter Haut und von Normalhaut jeweils mit und ohne vorherige Auslösung eines Kontaktekzems gewonnen, durchflußzytometrisch hinsichtlich ihrer Oberflächenmolekülexpression untersucht und anschließend auf ihre Fähigkeit zur Antigen-Präsentation gegenüber sensibilisierten T-Zellen untersucht. Hierdurch konnte gezeigt werden, daß die Anzahl von Makrophagen im Gewebe schon kurz nach Auslösung des Kontaktekzems zunimmt. Weiterhin wurde durch Depletion von I-A+ bzw. CD11b (Mac-1)+ Zellen untersucht, ob I-A+ Zellen (Langerhanszellen, dermale DC, Makrophagen), bzw. CD11b+ Zellen (weitgehend Makrophagen) für die Antigen-Präsentation in diesem System verantwortlich waren. Es zeigte sich jedoch, daß die verläßliche Isolierung der verschiedenen Zellpopulationen technisch schwierig ist, sodaß bislang keine komplett einheitlichen Ergebnisse generiert werden konnten. Funktionelle Untersuchungen waren besonders problematisch, da die hierzu erforderliche Zellzahl (besonders nach Auftrennung der Zellen in CD11b+ bzw. I-A+ Subpopulationen) oft nicht erreichbar war. Das zweite Problem war die ex-vivo Gewinnung von Hapten-reaktiven T Zellen aus Hapten-sensibilisierten Mäusen, die oft nur geringe Antigen-spezifische Proliferation aufwiesen. Trotz dieser Schwierigkeiten ist jedoch eindeutig, daß sowohl in Steroid-vorbehandelter Haut als auch in der Frühphase des Kontaktekzems Zellen in die Haut (sowohl Epidermis als auch Dermis) einwandern, deren Oberflächenmolekülexpression und Größe denen von Makrophagen entspricht (Grabbe 1996 (abstr.)). Diese Untersuchungen wurden in enger Kooperation mit der Arbeitsgruppe Sorg (Teilprojekt A8) durchgeführt, die uns insbesondere mit den immunhistologischen Untersuchungen wesentlich geholfen hat. Sie sollen auch in Zukunft weitergeführt werden, wobei wir derzeit versuchen, Hapten-spezifische T Zell-Klone hierfür zu erhalten (Kontakte zu Prof. Weltzien, Freiburg und Prof. Kripke, Houston, wurden aufgenommen), die diese Untersuchungen vereinfachen sollten. In einem parallelen Ansatz wurden immunhistologische Untersuchungen durchgeführt, um die durch topische oder systemische Kortisonapplikation bedingte Veränderung der zellulären Zusammensetzung der Dermis näher zu analysieren. Diese Untersuchungen ergaben ebenfalls eine Anreicherung mit Makrophagen als wesentlichen Befund und sind daher mit den durchflußzytometrischen Untersuchungen gut vereinbar. Daher wird unsere Arbeitshypothese, daß diese Zellen an der Antigen-Präsentation während der Auslösephase des Kontaktekzems beteiligt sind, unverändert aufrechterhalten. Diese Daten stimmen gut mit denen anderer Arbeitsgruppen überein, die in Ekzemreaktionen und v.a. nach UVB-Bestrahlung ebenfalls die Einwanderung von CD11b+ Makrophagen beschrieben haben (Baadsgaard O, Lisby S, Avnstorp C, Clemmensen O, Lange-Vejlsgaard G. Scand J Immunol 32:217-224, 1990; Hammerberg C, Duraiswamy N, Cooper KD. J Invest Dermatol 107:755-763, 1996), oder die ebenfalls die Antigenpräsentation durch unterschiedliche APC-Populationen untersuchten (Bacci S, Alard P, Dai R, Nakamura T, Streilein JW. Eur J Immunol 27:442-448, 1997). Weiterhin haben wir versucht, die funktionelle Relevanz dieser in die Haut nach Antigenapplikation einwandernden Makrophagen zu untersuchen. Dazu wurden Mäuse mit einer Spontanmutation im M-CSF Gen (sog. op/op Mutation), die nur noch sehr wenige Gewebsmakrophagen haben, hinsichtlich ihrer Regulation der Kontaktekzem-Reaktion untersucht. Hier zeigte sich jedoch, daß die Tiere in unserem Tierstall nur unzureichend gezüchtet werden konnten (Spontanletalität nach ca. 3-4 Wochen), und auch durch den Tierzuchtbetrieb selbst nicht in hinreichender Anzahl zur Verfügung gestellt werden konnten, um derartige Experimente durchzuführen. Zum anderen wurde versucht, durch Injektion von für Makrophagen selektiv toxischen Liposomen (beladen mit Cl2-MBP) gezielt Makrophagen in vivo aus der Haut zu depletieren. Die Injektion dieser Liposomen zeigte auch die erwarteten Resultate, nämlich daß nach Makrophagen-Depletion die Auslösung des Kontaktekzems deutlich beeinträchtigt ist (Grabbe 1996 (Abstr.)). Parallel durchgeführte immunhistologische Untersuchungen ergaben jedoch, daß durch die Injektion dieser Liposomen gleichzeitig eine starke subkutane Entzündungsreaktion ausgelöst wird, die die Interpretation dieser Ergebnisse sehr stark erschweren. Es ließ sich keine Toxindosis finden, die zwar Makrophagen eliminiert, aber keine wesentliche Entzündung verursacht, sodaß diese Strategie nicht weiter verfolgt wurde. Daraufhin haben wir uns entschlossen, uns dieser Fragestellung auf eine andere Weise zu nähern, die in der ursprünglichen Antragstellung nicht vorgesehen war. Um die für die Auslösung des allergischen Kontaktekzems relevanten APC zu identifizieren und um herauszufinden, ob nach Allergenapplikation in die Haut einwandernde nicht-residente APC hierfür verantwortlich sind, haben wir uns eines Mausmodells bedient, bei dem durch Gen-Targeting das CD18 Molekül inaktiviert wurde. Das CD18 Molekül ist für die Bildung der beta2 Integrine LFA-1 (CD11a/CD18), Mac-1 (CD11b/CD18) und p150/95 (CD11c/CD18) erforderlich. Über diese Moleküle werden eine Reihe von Funktionen gesteuert, die sowohl für die Antigen-Präsentation und Funktion von Dendritischen Zellen (DC) und Makrophagen als auch insbesondere für die Transmigration von Leukozyten aus dem Blut in entzündliche Gewebe verantwortlich sind. In einem ersten Schritt wurden diese von Frau Prof. Scharffetter-Kochanek, Universitäts-Hautklinik Köln, hergestellten CD18 knockout Mäuse durch unsere Arbeitsgruppe immunologisch untersucht. Es zeigte sich, daß diese Tiere einen sehr interessanten Phänotyp haben und vielerlei Abnormitäten bei fast allen Leukozytenpopulationen aufweisen (Scharffetter-Kochanek 1998). Daher hat sich die Charakterisierung dieses Mausstammes zu einem recht umfangreichen Projekt ausgeweitet, welches zahlreiche für dieses Projekt relevante Ergebnisse erbracht hat. Hierbei ergab eine Charakterisierung der T Zell-Funktion dieser Tiere eine fehlende homotypische T Zell-Aggregation, eine deutlich verminderte Stimulierbarkeit über TcR-vermittelte Signale (anti-CD3, gemischte Lymphozyten-Reaktion), jedoch eine verstärkte Stimulierbarkeit durch Mitogene und Lektine (PMA, ConA, Ionomycin). Weiterhin zeigte sich, daß CD18-defiziente Mäuse annähernd keine CD8+ T Zellen in Blut und Lymphknoten haben, zumindest ab einem gewissen Alter der Tiere. Hieraus ergibt sich, daß CD18 (1) für die homotypische Aggregation von T Zellen unabdingbar ist, (2) zur adäquaten TcR-vermittelten T Zellaktivierung beiträgt, und (3) an der Regulation von T Zell-Populationen, insbesondere der CD8+ T Zellen, beteiligt ist (Grabbe 1998 (Abstr)). In einem nächsten Schritt wurde die Bedeutung der beta2-Integrine für die Antigen-Präsentation untersucht, da ja jedes der von CD18 und CD11a/b/c gebildeten Heterodimere in hohem Maße auf APC exprimiert wird. Zunächst konnte nachgewiesen werden, daß die Abwesenheit von CD18 zu vollständig fehlender Expression von CD11a und CD11b führt, daß jedoch CD11c auch unabhängig von seinem heterodimeren Bindungspartner CD18 auf der Oberfläche von DC exprimiert wird (Roters 1998). Auf funktioneller Ebene zeigte sich, daß DC aus CD18-defizienten Mäusen keine dramatisch eingeschränkte Funktion haben, jedoch bei limitierten Antigenmengen deutlich geringere immunstimulatorische Kapazität als DC von Wildtyp-Mäusen aufweisen. Auch die homotypische Aggregation von DC und die Aggregation von DC mit T Zellen ist durch die Abwesenheit der beta2-Integrine nur gering beeinträchtigt. Somit sind beta2-Integrine und insbesondere die für DC und Makrophagen charakteristischen Moleküle CD11b und CD11c nicht von wesentlicher Bedeutung für die Antigen-Präsentation, sie erhöhen jedoch die Wahrscheinlichkeit einer produktiven Stimulation von T Zellen bei Antigenpräsentation. Schließlich wurde noch untersucht, ob beta2-Integrine für die Einwanderung von epidermalen Langerhanszellen in die Haut oder für deren Auswanderung nach Applikation eines Entzündungsreizes (z.B. Kontaktallergen) essentiell sind. Sowohl die Anzahl von Langerhanszellen in der Haut unter Normalbedingungen als auch ihre Auswanderung nach Applikation eines Kontaktallergens als auch die Repopulation der Haut mit neuen Langerhanszellen nach vorheriger Allergen-bedingter Auswanderung war jedoch normal. Hieraus ergibt sich, daß die akute Transmigration von Leukozyten in entzündliche Gewebe offensichtlich anderen Mechanismen unterliegt als die chronische Repopulation peripherer Gewebe mit residenten Zellen leukozytären Ursprungs. Nachdem nun also sowohl die T Zell-Funktion als auch die Funktion von APC sowie andere immunologische Parameter in diesen CD18-defizienten Mäusen definiert worden waren, haben wir untersucht, inwieweit die Ausbildung eines allergischen Kontaktekzems in diesen Tieren gestört ist. Es stellte sich heraus, daß Kontaktekzemreaktionen in CD18-defizienten Mäusen nicht auslösbar sind (>95% Reduktion gegenüber der Wildtyp-Kontrolle). In gleichartiger Weise ist auch die Immunreaktion vom verzögerten Typ ("delayed-type hypersensitivity", DTH) nach subkutaner Injektion von haptengekoppelten APC total blockiert. Dies wurde auch anhand von immunhistologischen Untersuchungen von Hautschnitten bestätigt, die ein fast vollständiges Fehlen von inflammatorischen Zellen am Ort der Allergenapplikation ergaben. Interessanterweise war jedoch die Ohrschwellungsreaktion nach Applikation eines Irritans nicht vermindert (wenngleich auch histologisch ein vermindertes zelluläres Infiltrat nachweisbar war), was zeigt, daß interstitielles Ödem und zelluläres Infiltrat bei der Ekzemreaktion eine voneinander getrennte Pathophysiologie haben und keinesfalls das Ödem die Folge des zellulären Infiltrats ist. Nachdem gezeigt werden konnte, daß CD18-defiziente Mäuse eine so profunde Reduktion des allergischen Kontaktekzems aufweisen, wurde als nächstes untersucht, ob CD18-defiziente Mäuse sensibilisierbar sind, oder ob die Blockade im Bereich der Auslösephase liegt. Daher wurden regionäre Lymphknoten von CD18-defizienten Mäusen nach epikutaner Sensibilisierung gewonnen und hinsichtlich einer proliferativen Antwort auf in vitro appliziertes Hapten und APC untersucht, wobei eine haptenspezifische Proliferation auch in CD18-defizienten Tieren nachweisbar war. Somit sind diese Tiere grundsätzlich sensibilisierbar, sodaß die Blockade der Kontaktekzemreaktion auf der Ebene der Auslösephase liegen muß. Dies ist auch plausibel, da beta2-Integrine ja von entscheidender Bedeutung für die transendotheliale Migration von Leukozyten in inflammatorische Gewebe sind. Um dies näher zu untersuchen, wurden Transfer-Experimente durchgeführt, in denen T Zellen aus regionären Lymphknoten von CD18-defizienten Mäusen präpariert wurden und unmittelbar nach Applikation eines Kontaktallergens direkt intrakutan in hapten-sensibilisierte, syngene CD18-defiziente Mäuse injiziert wurden. Auf diese Weise wurde die Notwendigkeit zur Extravasation der T Zellen umgangen. Es zeigte sich, daß hierdurch die Ekzemreaktion vollständig wiederhergestellt werden konnte, was darauf hindeutet, daß die Ursache der fehlenden Kontaktekzemreaktion in diesen Tieren tatsächlich in der Unfähigkeit der T Zellen zur Auswanderung aus dem Blut in hapten-applizierte Haut liegt. Somit konnte geklärt werden, daß beta2-Integrine absolut essentiell für die Auslösephase des allergischen Kontaktekzems sind. Diese Daten wurden z.T. bereits veröffentlicht, der Großteil steht jedoch noch zur Veröffentlichung an. Dieses Mausmodell, welches nun recht gut immunologisch untersucht ist, kann in Zukunft zur Klärung der Frage, welche APC für die Auslösung des Kontaktekzems relevant sind, verwendet werden. In Erweiterung der ursprünglichen Ziele des Vorantrags wurden noch zwei zusätzliche Versuchsreihen durchgeführt, anhand derer die Mechanismen der Antigen-Präsentation im Rahmen der Auslösephase des allergischen Kontaktekzems untersucht wurden. Zunächst wurde untersucht, ob zur Auslösung des Kontaktekzems MHC Klasse I oder MHC Klasse II Moleküle notwendig sind. Hierzu wurden MHC Klasse I-defiziente bzw. MHC Klasse II-defiziente Mäuse hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Generierung eines Kontaktekzems untersucht. Im Gegensatz zu kürzlich veröffentlichten Daten (Bouloc A, Cavani A, Katz SI. J Invest Dermatol 111:44-49, 1998), die zeitgleich mit der Durchführung dieser eigenen Untersuchungen publiziert wurden, konnten wir keine wesentliche Einschränkung des Kontaktekzems in MHC Klasse I-defizienten oder in MHC Klasse II-defizienten Mäusen finden. Der Unterschied zu den publizierten Daten mag hier in der Verwendung eines anderen Haptens sowie eines anderen Mausstammes liegen, ist aber ansonsten unklar. Unsere Untersuchungen zeigen jedoch, daß zumindest das von uns verwendete Hapten Oxazolon (OXA) weder ausschließlich über MHC Klasse I noch ausschließlich über MHC Klasse II erkannt und präsentiert wird. Interessanterweise konnte ein Kontaktekzem in MHC Klasse I-defizienten Mäusen sogar noch immer in vollem Umfang ausgelöst werden, wenn auch in der Haut befindliche MHC Klasse II+ Zellen durch topische Steroidapplikation zuvor depletiert worden waren. Diese Ergebnisse sind wiederum vereinbar mit dem Konzept, daß nicht ortsansässige, sondern kurz nach Allergenapplikation in die Haut einwandernde APC für die Präsentation des Allergens und die nachfolgende Auslösung des Kontaktekzems verantwortlich sind. Während wir jedoch bei der Erstantragstellung gemäß dem damaligen Wissensstand noch davon ausgegangen waren, daß die CHS eine obligat MHC II abhängige Reaktion ist, zeigten diese Untersuchungen, daß dies nicht der Fall ist. Daher sind unter Fortführung unserer bisherigen Arbeitshypothese weitere Experimente zur Aufklärung der Frage geplant, ob nicht ortsständige, in der Frühphase der Ekzemreaktion in den Ort der Allergenapplikation einwandernde APC für die Auslösung der Reaktion von Bedeutung sind, oder ob Antigenpräsentation durch ortsständige, in der Haut lokalisierte APC hierfür erforderlich ist. In Ergänzung zu den hier dargestellten Experimenten wurden noch weitere Versuchsreihen durchgeführt, die ebenfalls die Regulation und Pathophysiologie des allergischen Kontaktekzems zum Inhalt hatten. Diese Untersuchungen wurden im wesentlichen von nicht durch dieses Projekt geförderten Wissenschaftlern unserer Arbeitsgruppe durchgeführt, sind jedoch in diesem Rahmen von Interesse. Zum einen wurde untersucht, ob das Thy-1 (CD90) Molekül für kutane Immunantworten von Bedeutung ist. Thy-1 wird neben neuronalen Zellen selektiv von T Zellen und auch in geringen Mengen von Keratinozyten exprimiert, sodaß eine Untersuchung der Bedeutung dieses Moleküls für das Kontaktekzem und andere Immunreaktionen vom verzögerten Typ naheliegt. Hierzu wurden Thy-1-defiziente Mausstämme verwendet und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Produktion von T Zell-vermittelten Immunantworten untersucht (Beissert 1998). Es zeigte sich ein im wesentlichen normaler Immunstatus dieser Tiere, wobei allerdings Kontaktekzemreaktionen und insbesondere die aktivierungsabhängige Tyrosinphosphorylierung in T Zellen durch die Abwesenheit von Thy-1 inhibiert ist. Somit konnte nachgewiesen werden, daß Thy-1 für die antigenspezifische Aktivierung von T Zellen in vitro und in vivo von Bedeutung ist, wobei allerdings weder die Funktion antigenpräsentierender Zellen noch die der T Zellen durch die Abwesenheit dieses Oberflächenmoleküls fundamental gestört zu sein scheint. Eine andere Untersuchungsreihe unserer Arbeitsgruppe hatte zum Ziel, die Mechanismen der UV-induzierten Suppression des Kontaktekzems näher zu definieren. In diesem Zusammenhang konnte kürzlich gezeigt werden, daß zum einen die für die UV-bedingte Unterdrückung des Kontaktekzems verantwortlichen negativ regulatorischen T Zellen im wesentlichen CD8+ sind, und daß insbesondere die Funktion dieser negativ regulatorischen T Zellen über eine Beeinträchtigung der Antigen-Präsentation und in Fas(CD95)/FasL(CD95L) gesteuerter Weise zu erfolgen scheint. Es konnte hier durch Verwendung von Fas- bzw. FasL-defizienten Mäusen gezeigt werden, daß die UV-induzierte Suppression des Kontaktekzems nicht Fas/FasL abhängig ist, wohingegen die UV-bedingte Induktion einer langlebigen Immuntoleranz absolut Fas/FasL-abhängig ist (Schwarz 1998). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die für die Suppression des Kontaktekzems verantwortlichen negativ regulatorischen T Zellen die Apoptose von Hapten-tragenden APC verursachen und demzufolge die UV-vermittelte Toleranzinduktion anscheinend dadurch entsteht, daß in der Anwesenheit dieser negativ regulatorischen T Zellen eine effiziente Präsentation des Haptens verhindert wird. Im Rahmen einer klinischen Untersuchung ergab sich zusätzlich die Möglichkeit, den Einfluß von Steroiden auf die Auslösung des allergischen Kontaktekzems im Humansystem zu untersuchen. Ziel dieser Studie war es, die Bedeutung des TNF-Inhibitors Pentoxifyllin als potentielles immuntherapeutisches Agens zur Behandlung des allergischen Kontaktekzems beim Menschen zu untersuchen, da wir zeigen konnten, daß die systemische Gabe von Pentoxifyllin die Auslösephase des allergischen Kontaktekzems sowohl im Maussystem als auch beim Menschen unterdrückt (Schwarz A, Krone C, Trautinger F, Aragane Y, Neuner P, Luger TA, Schwarz T. J Invest Dermatol 101:549-552, 1993). Zusätzlich sollte diese Studie Aufschluß darüber geben, ob eine Depletion der epidermalen Langerhanszellen die Auslösbarkeit eines allergischen Kontaktekzems beeinflußt (Grabbe S, Steinbrink K, Steinert M, Luger TA, Schwarz T. J Immunol 155:4207-4217, 1995). Es zeigte sich, daß Pentoxifyllin ohne Effekt auf das Nickel-bedingte Kontaktekzem beim Menschen ist, und daß eine vorherige Steroidapplikation die Auslösung eines Kontaktekzems unterdrückt (Brehler 1998). Somit ergeben sich Unterschiede zwischen der Ekzemreaktion des Menschen und der Maus, wobei allerdings noch geklärt werden muß, ob die Steroidbehandlung im Humansystem zu einer adäquaten Depletion epidermaler Langerhanszellen geführt hat und ob noch eine immunsuppressive Restaktivität der Steroide zum Zeitpunkt der Allergenapplikation vorhanden war. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß unsere im Vorantrag formulierten Arbeitshypothesen weiterhin Bestand haben, und daß deren Bearbeitung zu wichtigen Erkenntnissen geführt hat, die in einer Reihe von Publikationen resultierten bzw. deren Publikation in Vorbereitung ist. Darüberhinaus wurden vielversprechende präliminäre Daten erhoben, die in den im folgenden beschriebenen Zielen der kommenden Antragsperiode weiter untersucht werden sollen. Von zentraler Bedeutung für die Pathophysiologie der Auslösephase des Kontaktekzems ist die Frage, ob die Rekrutierung von APC aus der Zirkulation in die Haut für die Auslöösung des allergischen Kontaktekzems notwendig ist, oder ob in der Haut befindliche APC dazu ausreichen. Zur Aufklärung dieser Frage wird das Modell der CD18-defizienten Mäuse einen wesentlichen Beitrag leisten. Darüberhinaus sollen gerade in Anbetracht der neuen Erkenntnisse, daß, im Gegensatz zur DTH-Reaktion, CD4+ T Zellen bei der CHS nicht von essentieller Bedeutung sind, die Pathophysiologie der Auslösephase von CHS und DTH verglichen werden. Da, wie oben dargestellt, die intraläsionale Injektion von Zytokinen eine nähere Charakterisierung der Natur des für die Auslösung des Kontaktekzems erforderlichen Entzündungsreizes nicht erlaubt hat, soll diese Frage nun durch Identifizierung der Zielzelle, an der Haptene diese unspezifische Wirkung ausüben, weiter bearbeitet werden.

Drittmittelgeber:

Deutsche Forschungsgemeinschaft

Beteiligte Wissenschaftler:

PD Dr. med. Stephan Grabbe (Teilprojektleiter), Prof. Dr. med. Thomas Schwarz (Teilprojektleiter), Dipl.-Biol. Berthold Roters (WM)

Veröffentlichungen:

Grabbe, S., M. Steinert, K. Mahnke, A. Schwarz, T.A. Luger, T. Schwarz: Dissection of antigenic and irritative effects of epicutaneously applied haptens in mice. Evidence that not the antigenic component but nonspecific proinflammatory effects of haptens determine the concentration-dependent elicitation of allergic contact dermatitis - J. Clin. Invest. 98: 1158-1164 - 1996

Grabbe, S., T. Schwarz: Immunoregulatory mechanisms involved in elicitation of allergic contact hypersensitivity - Am. J. Contact Dermatitis 7: 238-246 - 1996

Schwarz, A., S. Grabbe, K. Grosse-Heitmeyer, B. Roters, H. Riemann, T.A. Luger, G. Trinchieri, T. Schwarz: Ultraviolet light induced immune tolerance is mediated via the CD95/CD95-ligand system - J. Immunol. 160: 4262-4270 - 1998

Schwarz, A., S. Grabbe, K. Mahnke, H. Riemann, T.A. Luger, M. Wysocka, G. Trinchieri, T. Schwarz: IL-12 breaks UV light induced immunosuppression by affecting CD8+ rather than CD4+ T cells - J. Invest. Dermatol. 110: 272 - 276 - 1998

Grabbe, S., T. Schwarz: Immunoregulatory mechanisms involved in elicitation of allergic contact hypersensitivity - Immunol. Today 19: 37-44 - 1998

Scharffetter-Kochanek, K., H. Lu, K. Norman, N. vanNöd, F. Munoz, S. Grabbe, M. McArthur, I. Lorenzo, S. Kaplan, K. Ley, C.W. Smith, C.A. Montgomery, S. Rich, A. L. Beaudet: Spontaneous skin ulceration and defective T cell function in CD18 null mice - J. Exp. Med. 188: 119-131 - 1998

Brehler, R., O. Maurer, S. Grabbe, T. Schwarz: Topically applied pentoxifylline has no effect on allergic patch responses - J. Am. Acad. Dermatol. 39: 1017-21 - 1998

Beissert, S., H.T. He, A.O. Hueber, A. Lellouch, A. Mehling, T.A. Luger, T. Schwarz, S. Grabbe: Impaired cutaneous immune responses in Thy-1-deficient mice - J. Immunol. 161: 5296 - 5302 - 1998

Hakvoort, M. Haselbach, J. Wegener, D. Hoheisel und H.-J. Galla: The polarity of choroid plexus epithelial cells in vitro is improved in serum free medium - J. Neurochem71, 1141-1150 - 1998