Ludwig-Boltzmann-Institut für Zellbiologie und Immunbiologie der Haut
Exozytose in humanen Melamom- und Endothelzellen
Im Mittelpunkt der Arbeitsgruppe stehen Untersuchungen zu den Mechanismen der Exozytose in humanen
Melanomzellen und Endothelzellen. Im Vordergrund stehen hierbei die morphologischen Veränderungen,
wie Vesikeltransport zur Plasmamembran oder Vesikelfusion, die während der Exo- und Endozytose in
lebenden Zellen stattfinden. Exozytose “sichtbar“ zu machen verlangt eine Methode, die mit einer
hohen topographischen und zeitlichen Auflösung Substrukturen einer lebenden Zelle darstellen kann. Vor
18 Jahren wurde eine neue Abtasttechnik entwickelt, die so genannte Rasterkraftmikroskopie oder
“Atomic Force“-Mikroskopie, mit der es möglich ist, Oberflächen in verschiedenen
Flüssigkeiten hochauflösend (Nanometer-Auflösung) und drei-dimensional darzustellen. Die
Weiterentwicklung und Anwendung dieser Methode war und ist für unsere Untersuchungen notwendig,
um Exozytose an lebenden Zellen studieren zu können. In den letzten Jahren konnten wir mit der
Rasterkraftmikroskopie einzelne Exozytose-Ereignisse in der Plasmamembran lebender Pankreaszellen darstellen
und über Minuten verfolgen. Der “Blick“ auf die Zelloberfläche einer lebenden Zelle ist
nur mit der Rasterkraftmikroskopie möglich und damit einmalig. Dabei liefert die Rasterkraftmikroskopie
eine sehr hohe Sensitivität, d.h. kleinste morphologische Veränderungen werden registriert.
Weiterhin haben wir die Methode zum einem NanoSensor/NanoDetector weiterentwickelt. Hierbei beschichten
wir die AFM-Spitze mit unterschiedlichen Proteinen, um so intermolekulare Kräfte zu messen bzw. als
NanoDetector können wir individuelle Proteine mit hoher räumlicher Auflösung
(Nanometer-Auflösung) in der Plasmamembran orten. Die Beschichtung der Spitze mit z.B. Enzymen
erlaubt es das entsprechende sezernierte Substrat am Ort der Freisetzung, also direkt an der
Zelloberfläche, nachzuweisen.
Exozytose in humanen Melanomzellen
In Melanomzellen spielt die Exozytose von
Proteasen (u.a. von Matrixmetalloproteasen) eine wichtige Rolle bei der Migration und bei der Invasion. Ein
eigens entwickeltes Invasions-Assay ermöglicht die Quantifizierung der Invasivität und ihre
Abhängigkeit von der Proteasen Exozytose in Abhängigkeit von externen Stimuli oder Inhibitoren.
Mit der Kombination einer Fluoreszenzeinrichtung und der Rasterkraftmikroskopie sind topographische und
intrazelluläre Untersuchungen zur Exozytose zeitgleich möglich. Wir betrachten hier die Sekretion
der Matrixmetalloproteasen (MMPs), die in intrazellulären Vesikeln gespeichert werden und durch
Exozytose sezerniert werden. Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie kann die Vesikelfusion (Ort und Dauer)
dargestellt werden. In den letzten Jahren konnten wir zeigen, daß eine Inhibition der
MMP Exozytose zu einer geringeren Invasivität der Melanomzellen führt. Damit wäre
ein neuer Ansatz zur Therapie der Melanom-Metastasierung denkbar. Die Invasionsmessungen werden mit
einem von uns neuen zell-basierenden Invasions-Assay gemessen (hoher Zeitauflösung und hohe
Sensitivität).
Exo- und Endozytose in humanen Endothelzellen
Endothelzellen
besitzen große intrazelluläre Vesikel, die Weibel-Palade Körperchen (WPK) mit einer
Größe von 0.1 x 2 µm. Sie speichern den von Willebrand-Faktor (vWF), IL-8 und das
transmembranäre Protein P-Selektin. vWF dient der primären Hämostase und schützt
Faktor VIII vor dem proteolytischem Abbau. Das P-Selektin sitzt in der Vesikelmembran und wird nach der
Vesikelfusion in die Plasmamembran eingebaut. Es dient als Anker für Leukozyten und damit der initialen
und chronischen Entzündungsreaktion. Die WPK Exozytose kann durch physiologische Agonisten, wie
Thrombin oder Histamin, induziert werden. Die Größe und die Form der WPK machen diese Vesikel
zu leicht identifizierbaren intrazellulären Organellen in der Immunfluoreszenz. Mit Hilfe einer
GFP-Markierung (z.B. intrazelluläre Betrachtung via GFP-P-Selektin) und einer Kombination von
Fluoreszenz und Rasterkraftmikroskopie können WPK auf ihrem Weg zur Plasmamembran verfolgt
werden. Die Freisetzung des vWF und P-Selektin Expression benötigt nur wenige Sekunden und ist damit
schneller als bisher angenommen. Die Information über WPK-Transport und Einbau in die
Plasmamembran ermöglichte uns, eine Großzahl von grundlegenden Fragen während der
Exozytose beantworten zu können. Neben der GFP-abhängigen
Vesikel- bzw. Proteinmarkierung haben wir auch Fluoreszenzmethoden (z. B. FURA 2- oder
BCECF-Methode) etabliert, um intrazelluläre Ionenveränderungen während der Exozytose zu
messen. Eine Korrelation der intrazellulären Ca2+ Konzentration (Fluoreszenzmessung) mit der Dauer der
Fusion oder mit der Größe der Fusionspore (rasterkraftmikroskopische Messung) konnten wir z.B.
bei der Hypoxie-induzierten vWF-Sekretion zeigen.
