Fachbereich 05 - Medizinische Fakultät
Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie und operative Intensivmedizin
Experimentelle und Klinische Hämostaseologie

Hämostaseologie

Thrombozyten sind nicht nur die Steuerzellen der Hämostase, sondern auch Kernzellen der innaten Immunabwehr. Mit beiden Bereichen beschäftigt sich die Arbeitsgruppe.

Im Bereich Hämostase liegt der Schwerpunkt auf der Interaktion von Thrombozyten mit Proteinen der extrazellulären Matrix und mit anderen Zellen, wie Monozyten und Endothelzellen. Insbesondere die Steuerung der Blutgerinnung durch die Thrombozyten steht hier im Vordergrund. Im Gegensatz zu dem herkömmlichen Kaskadenmodell der Gerinnung, welches noch in den Lehrbüchern steht, geht man heute davon aus, daß die eigentliche Thrombinbildung, die zur Blutstillung benötigt wird, von den Thrombozyten gesteuert auf deren Oberfläche stattfindet (Kehrel, im Druck). Die Kenntnis der Proteinrezeptoren für klassische Gerinnungsfaktoren auf der Thrombozytenoberfläche und deren Signaltransduktionswege macht neue Ansatzpunkte zur Prophylaxe und Therapie von Thrombosen und vaskulären Erkrankungen, wie Schlaganfall und Herzinfarkt, möglich.

Beispielhaft erwähnt seien hier Ergebnisse, die im vom IZKF finanzierten Projekt C21 (Modulation der Affinität und/oder Avidität von Integrinen durch CD47 und u-PAR in vitro und in tierexperimentellen Modellen inflammatorischer Erkrankungen) von uns erzielt wurden. Wir konnten zeigen, daß Thrombospondin-1 (TSP-1) als Adhäsionsvermittler von Thrombozyten unter hohem Scherstress dient. Bei inflammatorischen, wie akuten thrombotisch arteriellen Gefäßerkrankungen, sind Interaktionen zwischen Thrombozyten und geschädigtem Endothel, bzw. extrazellulärer Matrix, von entscheidender Bedeutung. Bisher wurde der von Willebrand Faktor (vWF) als einzigartiges, adhäsives Substrat beschrieben, das eine Thrombusbildung unter hohem Scherstress, wie er z.B. in arteriosklerotisch verengten Gefäßen auftritt, ermöglicht. Im Gegensatz dazu konnte durch unsere in vitro Untersuchungen mit Hilfe von Durchflusskammerexperimenten und Scheraggregometrie TSP-1 als alternatives, thrombozytäres Adhäsionssubstrat bei hohen Scherkräften identifiziert werden (Optimum bei 50 dyn/cm2 ca. 4-fache Adhäsion im Vergleich zu statischen Bedingungen, p<0,005). Die Interaktion zwischen Plättchen und TSP-1 ist äußerst Scherstress-resistent (bis 4000s-1) und Ca2+-abhängig, wie entsprechende Experimente mit Ca2+-komplexierenden Antikoagulantien (Citrat, EDTA) zeigten. Plättchen eines Patienten, dem sowohl der vWF in den Plättchen als auch im Plasma vollständig fehlt, verhielten sich bei der Adhäsion an TSP-1 bei hohen Scherkräften wie Kontrollplättchen. Dieses Ergebnis zeigt, dass der vWF bei der Interaktion zwischen TSP-1 und gescherten Plättchen weder direkt, noch indirekt beteiligt ist. Ebenso konnte durch Experimente mit Plättchen von Glanzmann-Patienten mit GPIIbIIIa-Antagonisten, mit a2b1-defizienten Plättchen und mit funktionell inhibierenden monoklonalen Antikörpern nahezu ausgeschlossen werden, dass die Integrine aIIbb3 und a2b1, sowie das Integrin-assozierte Protein CD47 an der TSP-1 vermittelten Plättchenadhäsion unter hohen Scherkräften beteiligt ist. Dagegen konnte durch Untersuchungen mit funktionell inhibierenden Antikörpern, sowie durch Kompetitionsversuche, das Glykoprotein Ib als primärer TSP-1-Rezeptor auf gescherten Plättchen identifiziert werden. Diese neue GPIb-TSP-1-Adhäsionsachse bildet somit einen neuen therapeutischen Ansatzpunkt für Gefäßkrankheiten, deren Pathophysiologie nicht nur durch Thrombozyten-Endothel Interaktionen, sondern auch z.B. durch Leukozyten-Endothel Interaktionen charaktierisiert sind (näheres siehe Jurk et. al. FASEB J, in press). Desweiteren konnten wir zeigen, daß die Oberflächen-assoziierte Proteindisulfidisomerase (PDI) als Affinitätsmodulator des Integrins aIIbb3 dient. Die Modulation der Affinität von Integrinen für ihre Liganden stellt eine Schlüsselrolle für Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen dar. Affinitätsveränderungen, die zur Integrinaktivierung und somit zur Ligandenbindung führen, sind durch enorme Konformationsänderungen innerhalb der Integrin-Domänen geprägt, die mit spezifischen, redoxabhängigen Bindungsumlagerungen begleitet sind. In unseren Integrin-Funktionsuntersuchungen diente das plättchenspezifische und sehr gut untersuchte Integrin aIIbb3 als Modellsystem. In Aggregationsexperimenten konnte mit Hilfe von Membran-impermeablen Thiol-Blockern und spezifischen Inhibitoren der PDI gezeigt werden, dass durch PDI-bedingter Umlagerung freier Cysteinreste auf der Thrombozytenoberfläche die irreversible stabile Bindung des aIIbb3-Liganden Fibrinogen an aktivierten Thrombozyten ermöglicht wird. Durchflusszytometrische Untersuchungen mit den oben genannten Inhibitoren ergaben, dass nicht nur die stabile Bindung des Liganden Fibrinogen, sondern auch durch Ligandenbindung neu induzierte Epitope/Konformationen im aIIbb3-Integrin, sowie dessen Aktivierung selbst durch enzymatisch/PDI katalysierten Thiol-Redoxreaktionen auf der Thrombozytenoberfläche reguliert werden. Im Gegensatz zur Integrin-Ligandenbindung scheint die Agonisten-induzierte Plättchenaktivierung (z.B. P-Selektin Expression) Ectosulfhydryl-unabhängig zu erfolgen. Diese Ergebnisse verdeutlichen eine wichtige Beteiligung der enzymatisch/PDI katalysierten Disulfid-Umlagerungen an der Affinitätsregulierung von Integrinen auf der Zelloberfäche. (siehe Lahav et al. Blood 2002). Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Wirkung von Schlangengiftkomponenten auf Thrombozyten und deren Signaltransduktionswegen zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. K.J. Clemetson sind in Dörmann et. al. 2001 und Navdaev et. al. 2001 beschrieben. Mit der Arbeitsgruppe von Dr. R. Nofer untersuchten wir Thrombozyten von Patienten mit Tangier-Erkrankung (ABCA-1 Defizienz) und beschäftigten uns mit neuen Rollen von HDL, bei der Entstehung von arteriosklerotischen Plaques. (Nofer et al 2002 und in press , sowie Patentantrag PCT-Anmeldung Kehrel 2001b). Im letzten Abschnitt des IZKF Projekts A6 untersuchten wir die Interaktion von Blutplättchen mit Leukozyten. In Kooperation mit der Klinik für Neurologie erfolgte eine prospektive Studie an Patienten mit asymptomatischen, hochgradigen Stenosen (>70%). Dabei stand die klinische Bedeutung der Assoziation zwischen Thrombozyten und Leukozyten im Vordergrund. Im Vollblut von Patienten mit echoarmen und echoreichen Stenosen wurden signifikant erhöhte Plättchen-Monozyten- bzw. Plättchen-neutrophile Granulozyten (PMNL)-Assoziate durchflusszytometrisch detektiert. Dabei lag die Rate der Assoziation zwischen Plättchen und Leukozyten von echoarmen Patienten mit ca. 50% vergleichbar hoch, wie bei Patienten mit akutem Schlaganfall, und konnte bei beiden Patientengruppen durch Thrombinstimulierung in vitro nicht signifikant gesteigert werden. Sowohl bei Monozyten als auch bei PMNL von Patienten mit echoarmen Carotisstenosen konnte im Gegensatz zu Patienten mit echoreichen Carotisstenosen eine signifikant erhöhte Oberflächenpräsentation des Adhäsionsmoleküls TSP-1, sowie des b2-Integrins CD11b beobachtet werden. Im Gegensatz dazu exprimierten die Thrombozyten dieser Patienten die Aktivierungsmarker P-Selektin, TSP-1 und CD63 nicht vermehrt auf ihrer Oberfläche. Sowohl die Thrombozyten, als auch die Leukozyten von Patienten mit akutem Schlaganfall verhielten sich refraktär bezüglich des Agonisten Thrombin. Dagegen konnten sowohl die Plättchen, als auch die Monozyten, bzw. PMNL von Patienten mit echoarmen, wie echoreichen Stenosen, weiterhin durch Thrombin in vitro stimuliert werden. Diese Ergebnisse sind zur Publikation eingereicht.

Auf der anderen Seite ergeben sich aus dem neuen Verständnis der Hämostase Perspektiven für eine effektivere Blutstillung bei Operationen, die zum Einsparen von Blut-Transfusionen führen. Hier führten wir Untersuchungen zum Wirkmechanismus von rFVIIa und zur Verbesserung von Vliesen durch, die zur Blutstillung eingesetzt wurden. Diese Projekte wurden von der Industrie finanziert. Aus dem neuen Verständnis, wie die Blutgerinnung und die Thromboseentstehung funktionieren, entsteht der Bedarf, dies auch diagnostisch nutzen zu können. Daher wird an der Entwicklung einfacher, präziser Testmethoden zur Untersuchung der Hämostase gearbeitet. Für die Diagnostik von Thrombozytopathien wurden Methoden entwickelt, welche die Differentialdiagnostik erleichtern und Untersuchungen auch bei Säuglingen und/oder unter Thrombozytopenie erlauben. Daher dient die Arbeitsgruppe seit vielen Jahren als Referenzzentrum für die Diagnostik dieser Erkrankungen. Zusammen mit der Kinderklinik wurden für diese neuen Methoden Normalwerte für Kinder unterschiedlichen Alters ermittelt und auf dem Meeting des “Scientific and Standardisation Commitees“ der Internationalen Thrombose- und Hämostasegesellschaft (ISTH) vorgestellt. Zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. Morgenstern gingen wir der Frage nach, welcher Vorgang bei der Aktivierung der Blutplättchen zuerst passiert, der Formwandel oder die Aggregation. Nach Aktivierungszeiten von 1,5 sec konnten wir Aggregation von noch diskoiden Plättchen beobachten. Daneben konnten wir zeigen, daß Blutplättchen, wie epitheliale Zellen, in einer späteren Phase der Aggregation s.g. “tight junctions“ ausbilden können. Auch diese Ergebnisse sind zur Publikation eingereicht worden.

Einerseits sind Infektionen und entzündliche Erkrankungen ein Trigger für thromboembolische Ereignisse (tiefe Beinvenenthrombose, Lungenembolie, u.a.) und Gefäßwanderkrankungen, andererseits beeinflussen Veränderungen der Hämostase entzündliche Erkrankungen, wie Ischämie- Reperfusionsschäden, Sepsis und andere. Die Arbeitsgruppe hat sich zum Ziel gesetzt, die zugrunde liegenden Pathomechanismen aufzuklären und auf dem Hintergrund dieses neuen Wissens neue Wege für die Therapie dieser Erkrankungen aufzuzeichnen.

Die Ergebnisse führten unter anderem in die Patentanmeldungen WO 02/22150A2 und WO 02/32445A2. Der zweite Schwerpunkt der Arbeitsgruppe liegt in der Erforschung der Rolle der Thrombozyten bei der innaten Immunabwehr. Bakterien, Pilze, Parasiten , Viren und Tumorzellen binden an Thrombozyten. Thrombozyten können diese “Körperfeinde“ aktiv abtöten. Die Bedingungen, unter denen dies geschieht, und die zugrunde liegenden Mechanismen werden untersucht. Neben einer direkten Wirkung der Thrombozyten wirken diese aber auch indirekt, indem sie mit den Leukozyten und dem Endothel wechselwirken. Im SFB 293 geförderten Projekt A6 wurde z.B. die Interaktion von S. aureus mit Blutplättchen untersucht Zu den schwersten Verlaufsformen invasiver, durch S. aureus verursachter Infektionen, zählen solche, die durch ihre endovaskuläre Manifestation charakterisiert sind. Das Teilprojekt A6 (Heilmann/Peters/Kehrel) befaßte sich daher mit der Anhaftung von S.aureus an die Gefäßwand und der Aktivierung/ Schädigung des vaskulären Endothels bei S. aureus Infektionen. Die biomolekularen Interaktion der Thrombozyten mit Endothel und mit S.aureus und die molekularen Bedingungen der Thrombozytenaktivierung durch S.aureus wurden untersucht. So fanden wir, daß Thrombozyten PSGL-1 in ihrer Plasmamembran exprimieren und über eine P-selectin/ PSGL-1 Brücke an aktiviertes Endothel adhärieren können. Es gelang uns zu zeigen, daß für die Assoziation der Bakterien an Thrombozyten sowohl der Aktivierungszustand an sich, als auch das Vorhandensein von löslichem Fibrin essentiell sind. Daraus ergibt sich, daß bei Endokarditis, bedingt durch eine Infektion mit PMBP (platelet-microbicidal proteins)-resistenten Bakterien, eine Zusatzbehandlung mit “Thrombin-Hemmern“, die sowohl die Plättchenaktivierung, als auch die Entstehung von Fibrin hemmen, einen therapeutischen Nutzen für die Patienten bringen könnte. Weiterhin konnten wir zeigen, daß essentielle Grundlage für die Ausprägung eines prokoagulanten Zustands, und damit für die Fibrinentstehung auf der Plättchenoberfläche, eine Bindung von Thrombin an das Glykoprotein Ib ist. Granulaproteine sind für die S. aureus-Thrombozyten-Assoziation von besonderer Bedeutung, wie Untersuchungen an Patienten mit dem äußerst seltenen Gray-platelet-Syndrom (Fehlen der alpha-Granula) zeigten. Das gesuchte “Vermittlerprotein“ wurde als Thrombospondin identifiziert. Die Ergebnisse wurden zur Publikation eingereicht. Aus Überständen aktivierter Thrombozyten wurde ein Peptid isoliert, welches in der Lage ist, einige pathogene Bakterien, Viren, Pilze, Parasiten und Tumorzellen abzutöten. Ein entsprechender Patentantrag ist in Bearbeitung.

In einem anderen vom IZKF geförderten Projekt B11 “Zielgerichteter Transport antimikrobieller Substanzen durch Thrombozyten bei Staphylococcus aureus-Endokarditis“ werden Blutplättchen als trojanische Pferde zum zielgerichteten Transport von Medikamenten eingesetzt. Die durch Staphylococcus aureus ausgelöste Endokarditis ist eine fulminant und oft deletär verlaufende Erkrankung. Dem Pathomechanismus liegt primär eine Schädigung der Endothelzell-Gefäßwandauskleidung zugrunde. An das freigelegte Subendothel lagern sich Thrombozyten an. Proteine der Matrix, des Plasma und die Thrombozyten bilden gemeinsam den Nidus für eine konsekutive Kolonisierung für Staphylokokken aus der Blutbahn. Alleinige antimikrobielle Therapie versagt oft, da es zur Bildung von Klappenvegetationen kommt und wirksame, suffiziente Spiegel von antimikrobiellen Substanzen wegen der schlechten Durchblutung des Klappengewebes und der schlechten Penetration in die Klappenvegetationen nicht erreicht werden können. Das Projekt beruht auf der natürlichen Funktion von Thrombozyten, sowohl an die geschädigte Gefäßwand, als auch an Staphylokokken zu binden. Antibiotika werden in Thrombozyten enkapsuliert, welche diese Medikamente am Ort der Infektion im direkten Kontakt mit den Bakterien dann freisetzen. Übergreifendes Ziel ist es, die potentielle klinische Anwendbarkeit dieses neuartigen Verfahrens zu evaluieren

Beteiligte Wissenschaftler:

Prof. Dr. rer. nat. Beate E. Kehrel (Leitung); Arzt Bichel, Jens; cand. med. Bödeker, Daniel; Dipl.-Chem. Brodde, Martin; Dipl.-Biol. Engelbert, Silke; Arzt Froer, Michael; Dipl.-Chem. Glauner, Martin; cand. med. Graf von Königsmarck, Joachim; Dr. med. Jahn, Ulrich-Rüdiger; Tierärztin Horn, Meike; Dr. rer. nat. Jurk, Kerstin; Niehues, Ulrike (BTA); Tierärztin Niemann, Mareike; cand. med. Pauli, Timo; cand. med. Roberts, Stefanie; cand. med. Schriek, Carsten; Ärztin Szpunar, Grazynar; cand. med. Trenkmann, Katrin; cand. med. Wagner, Herdis; Ärztin Wigbels, Brigitte; cand. med. Wischmeyer, Daniela Kooperationen außerhalb des UKM Prof. Dr. Kenneth J. Clemetson, Theodor Kocher (Institut der Universität Bern); Prof. Dr. Judith Lahav, (University of Tel Aviv); Prof. Dr. Eberhard Morgenstern, (Universität des Saarlandes); Prof. Dr. Michael Barnes, (Dept. of Biochemistry, University of Cambridge, UK); Prof. Dr. Jan J. Sixma, (Academisch Ziekenhuis Utrecht); Prof. Dr. Phlip de Groot, (University Utrecht); Prof. Dr. Barry S. Coller, (Mount Sinai Medical Center, New York); Prof. Dr. Reinhard Fässler, (Experimentelle Pathologie, Universität München); Drs. Olle Korsgren und Bo und Kristina Nielson, (Institut für Immunologie und Transplantationsmedizin, Universität Uppsala); Dr. Jan Schulte am Esch, (Universitätsklinikum Eppendorf); Prof. Dr. Claus Hemmer, (Institut für Chirurgische Forschung, Maximilians Universität München); Dr. Michael Schreiber, Bernard Nocht (Institut für Tropenmedizin, Hamburg); Dr. Michael Steiner, (Klin. Chemie und Pathobiochemie Universität Rostock); Dr. Christoph Hemmer, (Tropenmedizin und Infektiologie, Universität Rostock); Prof. Dr. Naphthali Savion, (Goldschleger Eye Research Institut, Universität Tel Aviv); Prof. Dr. David Varon, (University of Jerusalem); Prof. Dr. Peter Newman, (Blood Center of SW Wisconsin); Prof. Dr. Eric Brown, (University of Calif. San Francisco); Prof. Dr. Jack Lawler, (Harvard Medical School, Boston)

Publikationen 2001-2002:

Patentanträge

2001a Internationale PCT Anmeldung WO 02/22150A2; Arzneimittel enthaltend aktiviertes Antithrombin III 2001b Internationale PCT Anmeldung WO 02/32445A2 ; Oxidierte Proteine - Ihre biologische Wirkung, sowie therapeutische und diagnostische Massnahmen, die sich aus dem Wirkmechanismus, dem Einsatz dieser Proteine oder deren Inhibierung ableiten. Artikel in Zeitschriften Dörmann D, Clemetson JM, Navdaev A, Kehrel BE, Clemetson KJ: Alboaggregin A activates platelets by a mechanism involving GPVI as well as GPIb. Blood , 97(4), 929-936, 2001

Navdaev A, Clemetson JM, Polgar J , Kehrel BE, Glauner M, Magnenat E, Wells TNC, Clemetson KJ: Aggretin, a heterodimeric C-type lectin from Calloselasma rhodostoma (Malayan pitviper) stimulates platelets by binding to a2b1integrin and gp Ib, activating syk and PLCg2, but does not involve the GPVI /Fcg collagen receptor. JBC 276, 20882-89, 2001

Nofer JR, Kehrel BE, Fobker M, Levkau B, Assmann G, von Eckardstein A: HDL and arteriosclerosis: beyond reverse cholesterol transport . Atherosclerosis 2002 Mar;161(1):1-16.

Heilmann C, Herrmann M, Kehrel BE, Peters G.: Platelet-Binding Domains in 2 Fibrinogen-Binding Proteins of Staphylococcus aureus Identified by Phage Display. J Infect Dis. 2002 Jul 1;186(1):32-9.

Lahav J, Jurk K, Hess O, Barnes M, Farndale RW, Luboshitz J, Kehrel BE: Sustained integrin ligation involves extracellular free sulfhydryls and enzymatically catalyses disulfide exchange. Blood 100, 2472-2478, 2002

Beate E Kehrel: Plättchenbiochemie und -physiologie. Haemostaseologie in press

Jurk K, Clemetson KJ, de Groot Ph, Van Aken H, Glauner M, Brodde M, Steiner M, Varon D, Savion N, Sixma JJ, Kehrel BE: New, von Willebrand factor independent mechanism for platelet adhesion under high shear- Thrombospondin-1/Gplb axis. FASEB J. in press

Eingereichte Arbeiten: Jurk K, Jahn U-R, Van Aken H, Schriek C, Droste DW, Ritter MA, Kemeny V, Ringelstein EB, Kehrel BE: Platelets in patients with acute ischemic stroke are refractory to thrombin, due to cleavage and internalization of the seven-transmembrane thrombin receptor (PAR-1). Resubmitted: Thrombosis and Haemostasis

Engelbert S, Köhler N, Van Aken H, Morgenstern E, Peters G, Hermann M, Kehrel BE: Soluble fibrin is the main mediator of S. aureus adhesion to platelets. Submitted

Nofer JR, Szpunar G, Morgenstern E, Seedorf U, Assmann G, Kehrel BE: Impaired platelet activation by collagen in ABCA1 deficiency. Submitted

Boeckel N, Kehrel BE, Brodde MF , Lüscher EF, Morgenstern E.: Platelet aggregation: The first events and the character of different inter-platelet contacts Submitted