Genotypisierung und molekulare Diagnostik von Hefen und anderen Mikroorganismen

Parallel zur steigenden Inzidenz nosokomialer Infektionen durch Hefen der Gattung Candida sind Veränderungen in der Epidemiologie von Candida-Mykosen mit einem zunehmenden Anteil von non-C. albicans-Hefen zu verzeichnen, die sich durch ihre potentielle Antimykotika-Resistenz auszeichnen. Moderne molekularbiologische Verfahren, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), können die oftmals zeitaufwendigen, teilweise wenig spezifischen Methoden der konventionellen Diagnostik von Mykosen ergänzen. Zur Aufklärung epidemiologischer Zusammenhänge einschließlich der Infektionsquellen und -wege stellen die modernen Genotypisierungsverfahren potente Werkzeuge dar.

Für eine Reihe weiterer Mikroorganismen (u.a. Plasmodien, Mykoplasmen) wurden amplifikationsgestützte molekularbiologische Nachweis- und Identifizierungssysteme evaluiert, optimiert und an verschiedene Untersuchungsmaterialien adaptiert.

Hierzu wurden folgende Themen bearbeitet:

1. Für C. glabrata und andere non-C. albicans-Hefen wurden Random-Primer entwickelt und auf ihre Eignung zum Einsatz in der Arbitrarily-primed (AP)-PCR getestet. Für die AP-PCR wurden die Reaktionsparameter optimiert und die Parameter Typisierbarkeit, Reproduzierbarkeit, Diskrminierbarkeit und Stabilität evaluiert. Die optimierte AP-PCR wurde für die Genotypisierung von Hefen verschiedener deutscher und ungarischer Stämme eingesetzt.
2. Für die AP-PCR zur Genotypisierung von Hefen wurden die Ramp-Zeiten im Thermocycler-Profil näher definiert und ihr Einfluß auf die Diskriminierbarkeit von Candida-Stämmen untersucht.
3. Ausgehend von den in der AP-PCR generierten Stamm-Pattern wurde nach genus-, spezies- und stammspezifische Merkmalen im Bandenmuster gesucht und für C. glabrata speziesspezifische Banden ausgewählt, die DNA extrahiert, aufgereinigt und direkt sequenziert. Mittels Sequenzvergleich der EMBL-Datenbank konnte gezeigt werden, daß es sich um mitochondriale ribosomale Sequenzen handelte. Ausgehend von der erhaltenen Sequenz wurden putativ speziesspezifische PCR-Primer generiert und auf ihre Spezifität zum Nachweis von C. glabrata evaluiert.
4. Zum post-mortem Nachweis einer Malaria wurde in Zusammenarbeit mit dem Institut für Rechtsmedizin PCR-Methoden zur Amplifizierung von Plasmodien-DNA evaluiert und für verschiedene Untersuchungsmaterialien getestet.
5. Zum molekularbiologischen Nachweis und zur Differenzierung von Mykoplasmen aus Zellkulturen und klinischen Untersuchungsmaterialien wurden verschiedene Amplifizierungs- und Sequenzierungsstrategien getestet und eine Stufendiagnostik entwickelt.

Beteiligte Wissenschaftler:

Dr. med. Karsten Becker, Dr. vet. med. Dörte Badehorn, PD Dr. med. Wolfgang Fegeler

Veröffentlichungen:

K. Becker, D. Badehorn, S. Deiwick, G. Peters, W. Fegeler: Molecular genotyping of Candida species with special respect to Candida (Torulopsis) glabrata strains by arbitrarily primed PCR. J. Med. Microbiol. 49 (6) 2000 575-581

P. Ellinghaus, D. Badehorn, R. Blümer, K. Becker, U. Seedorf: Increased efficiency of arbitrarily primed PCR by prolonged ramp times. Biotechniques 26 (4) 1999 626-630

K. Becker: Molekularbiologische Differenzierungsverfahren bei Hefen. Mycoses 43 (Suppl. 1) 2000 40-47

K. Becker, A.-F. Schmalreck, D. Badehorn, I. Török, G. Peters, W. Fegeler: Typing of Candida (Torulopsis) glabrata by arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) and Fourier transform-infrared spectroscopy (FT-IR). 5th Congress of the European Confederation of Medical Mycology. Dresden, 3.-6.6.1999, P 74. Mycoses 1999 42 (3) 165-166

K. Becker, D. Badehorn, B. Keller, M. Schulte, K.H. Böhm, G. Peters: Isolation and characterization of C. glabrata-specific PCR primers derived from a random amplified DNA fragment. 6th Congress of the European Confederation of Medical Mycology Societies, Barcelona, Spain, 09.-11.11.2000, P3-004. Rev. Iberoamer. Micol. 17 (3) 2000 S130

K. Becker, C. Ortmann, T. Bajanowski, B. Brinkmann, G. Peters: The use of polymerase chain reaction for post-mortem diagnosis of malaria. Diagn. Mol. Pathol. 8 (4) 1999 211-215

J. Denecke, K. Becker, H. Jürgens, R. Gross, J.E.A. Wolff: Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to Mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 19 (2A) 1999 1245-1248