Biomedizinische Analytik
Struktur, posttranslationale Modifikationen und Funktion von Proteinen 1
Identifizierung und Sequenzierung von Proteinen durch proteolytischen Verdau in der Elektrospray-Kapillare und
gleichzeitige massenspektrometrische Analyse der
entstandenen Peptide
Die Standard-Verfahren für die Proteomanalytik weisen zwei wesentliche Nachteile auf: Zum Einen sind
sie (sehr) zeitaufwendig, zum Anderen gehen bei der
Aufreinigung der proteolytischen Produkte kleine und/oder hydrophile Peptide, die nicht an das i.d.R. verwendete
RP18-Material binden, und große und/oder hydrophobe
Peptide, die nicht wieder eluieren, verloren. Beide Nachteile lassen sich vermeiden, wenn der proteolytische Verdau in
der Elektrospray-Kapillare bei gleichzeitiger Analyse der
Peptide stattfindet.In einem ersten Versuch wurde Pferde-Myoglobin mit Trypsin in der Elektrospray-Kapillare verdaut
und gleichzeitig ESI-Massenspektren der tryptischen
Peptide aufgenommen. Neben sehr kleinen Peptiden wie KK ([M+H]+ bei m/z 275.18)
konnten auch sehr große tryptische Peptide wie das
Peptid AS1-31 ([M+3H]3+ bei m/z 1135.15) detektiert werden. Insgesamt ergab sich eine
Sequenzabdeckung von 100%. Zudem war es
möglich während des laufenden Verdaus CID-Experimente zur Sequenzierung von tryptischen Peptiden
durchzuführen.Wurden Rinder-Serumalbumin (ca.
66 kD) und Rinder-Transferrin (ca. 78 kD) im in-Kapillar-Verdau mit Trypsin im umgesetzt und die
proteolytischen Peptide im Verlauf des Verdaus analysiert, so
konnten - vermutlich wegen der erhalten gebliebenen Disulfidbrücken - entsprechend niedrigere
Sequenzabdeckungen (44.2% für Albumin und 44.7% beim
Transferrin) erhalten werden. Dennoch reichten die detektierten Peptide für eine problemlose und eindeutige
Identifizierung der Proteine, entweder über den
"peptide map" oder nach CID über die Sequenzen, aus.
Die Anwendbarkeit der Methode auf Proteingemische
wurde am Beispiel einer Protein-Präparation aus
Elefantenmilch demonstriert. Nach tryptischem in-Kapillar-Verdau, CID der entstehenden Peptidionen, Sequenzierung
und Homologiesuche mit dem Programm BLAST konnten
vier Casein-Typen (α-s1-, β-, δ- und κ-Casein) sowie Laktoferrin nachgewiesen
werden.Unsere Ergebnisse zeigen, dass der proteolytische Verdau
intakter Proteine in der Elektrospray-Kapillare mit gleichzeitiger MS-Analyse der entstandenen Peptide eine schnelle
und einfach durchzuführende Methode zur
Protein-Identifizierung und -Sequenzierung ist. Sie liefert ein Maximum an Strukturinformation, da keine Verluste durch
Reinigungsschritte auftreten und jedes ionisierbare
Peptid detektiert wird. Das Verfahren ist auch auf Proteingemische anwendbar.
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