Fachbereich 05 - Medizinische Fakultät
Institut für Medizinische Mikrobiologie
Biologie und Pathogenese von Staphylokokken-Infektionen

Zelluläre Mikrobiologie von Staphylococcus aureus

Interaktion von Bakterien mit Wirtszellen und Extrazellulärer Matrix:Adhärenz, zelluläre Invasion, intrazelluläre Replikation und Induktion von Apoptose. S. aureus ist ein extrem vielseitiger Mikroorganismus, der eine ganze Reihe verschiedener Infektionen verursachen kann. Diese Vielseitigkeit spiegelt sich in der großen Zahl verschiedener, aber auch teilweise redundanter Virulenzfaktoren von S. aureus wieder. Abgesehen von Toxin-vermittelten Erkrankungen sind dabei Adhärenz an Wirtsstrukturen (Zellen und Matrix), sowie Invasion von Wirtszellen von entscheidender Bedeutung. Vor allem nach hämatogener Aussaat kann S. aureus langwierige und schwierig zu behandelnde Infektionen (Endokarditis, Osteomyelitis) verursachen. Inzwischen gibt es Befunde in vivo, die belegen, daß dies entscheidend mit der zellulären Invasivität von S. aureus verknüpft ist. Intrazellulär vorliegende Staphylokokken sind vermutlich vor der Wirtsabwehr und vielen Antibiotika geschützt. Andererseits kann S. aureus Wirtszellen abtöten, sei es durch nekrotischen oder apoptotischen Zelltod. Eine Reihe von Faktoren werden hierfür verantwortlich gemacht, jedoch ist die jeweilige Rolle bisher noch recht wenig verstanden.

S. aureus-Invasion: Oberflächeninteraktion von S. aureus mit nicht-professionellen Phagozyten: Der von uns und anderen Arbeitsgruppen in den letzten Jahren in wesentlichen Zügen aufgeklärte Invasionsmechanismus von S. aureus wird im Detail durch neuere Befunde erweitert. Unsere bisherigen Befunde ergaben, daß die S. aureus-Invasion Ähnlichkeiten mit der professionellen Phagozytose aufweist (F-Aktin-Polymerisierung, Reißverschlußmechanismus), und daß sowohl das Fibronektin-bindende Protein A als auch B (FnBPA und FnBPB), als Invasin wirken. Die Brückenbildung durch wirtseigenes Fibronektin zu Integrin a5b1 vermittelt dabei die Aufnahme in die Wirtszelle. Neben den bisher bekannten Fibdronektin-bindenden D-Domänen der FnBPs ist offensichtlich die B-Domäne von FnBPA entscheidend beteiligt. Wir untersuchen zur Zeit die FnBPs verschiednener Stämme auf ihre Funktion. Obwohl Invasivität eine Eigenschaft von allen untersuchten klinischen Isolaten ist, scheint es Unterschiede zu geben. Einzelne Laborstämme, aber auch einige MRSA-Isolate (Methicillin-resistenter S. aureus) sind deutlich geringer invasiv. Wir untersuchen den Einfluß von strukturellen Unterschieden der FnBPs und von anderen Oberflächenproteinen, wie z.B. Eap (“extracellular adherence protein“) und Pls (“plasmin-sensitive“; in Zusammenarbeit mit Katri Savolainen-Juuti und Pentti Kuusela, Helsinki, Finnland) auf die Invasivität.

S. aureus–Invasion: Intrazelluläre Folgereaktionen und Vesikel-Reifung: Analog wie bei professionellen Phagozyten, wird S. aureus in vesikulären Strukturen internalisiert. Diese phagosomenähnlichen Vesikel durchlaufen ebenfalls Reifungsprozesse: massive Ansäuerung und Phagosom-Lysosom-Fusion (LAMP-1). Wie erwartet, gibt es hierbei Stamm- und auch Wirtszell-Unterschiede. Morphologisch scheinen manche S. aureus– Stämme dem Phagosom entkommen zu können. Inwieweit nicht-professionellen Phagozyten effizient internalisierte Bakterien abtöten können untersuchen wir derzeit. Hierbei ist die Rolle der ATPase ClpC, einem Chaperon der Hsp100-Familie besonders interessant, da es neben der Invasivität auch intrazelluläre Vorgänge zu beeinflussen scheint (Kooperation mit der Arbeitsgruppe Mathias Herrmann, Homburg/Saar).

Die Internalisierung von S.  aureus durch eukaryonte Zellen als pathogenetischer Mechanismus der persistierenden Infektion: Wir konnten zeigen, dass S. aureus von einer respiratorischen Epithelzellinie internalisiert wurde. Nach einer Anpassungszeit begannen sich die Bakterien intrazellulär zu teilen und induzierten auf diese Weise Apoptose. Diverse S. aureus Laborstämme und Mutanten unterschieden sich in ihrem Potential internalisiert zu werden, sich intrazellulär zu replizieren und Apoptose auszulösen. Insbesondere kommt auch hier den globalen Regulatoren verschiedener Virulenzgene und deren Mutanten eine besondere Bedeutung zu.

Apoptose-Induktion durch S. aureus bei Leukozyten und nicht-professionellen Phagozyten: In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Schulze-Osthoff (jetzt Düsseldorf) konnten wir S. aureus a-Toxin als Induktor von Apoptose bei Jurkat-T-Zellen identifizieren. Daran ist offensichtlich der mitochondriale Signalweg beteiligt, ohne den Rezeptor-vermittelten Weg zu benötigen, da Jurkat die CD95-defizient, FADD-defizient, oder Caspase-8-defizient sind, sich nicht erkennbar von WT-Zellen unterscheiden. Die Induktion von Apoptose ist begleitet von Freisetzung von Cytochrom-c und einem reduzierten mitochondrialem Membranpotential. Überexpression von Bcl-2 kann die a-Toxin-induzierte Apoptose hemmen. Interessanterweise ist neben der Effektorcaspase (Casp-3) und der mitochonrialen Initiatorcaspase (Casp-9) auch Casp-8 aktiviert. Für die Induktion von Apoptose ist a-Toxin sowohl notwendig als auch hinreichend, wie wir mit isogenen Mutanten zeigen konnten. Wir führen die Untersuchungen mit frisch isolierten Mononukleären Zellen fort, um Unterschiede und Gemeinsamkeiten mit nicht immortalisierten Zellen zu identifiezieren. Daneben verwenden wir Endothelzellen, um zu untersuchen, welche Rolle Invasion bei der Induktion von Apoptose durch S. aureus spielt.

Emp- und Eap-vermittelte Interaktion mit Matrix-Suprastruktur: Bisher ist weitgehend unbekannt, wie Staphylokokken mit organisierten Matrixmakromolekülen interagieren. Unsere bisherigen Befunde deuten auf eine offensichtlich hohe funktionelle Redundanz der löslichen Adhäsine Emp (“extracellular matrix protein-binding protein“) und Eap (“extracellular adherence protein“) in rekombinanter Form hin. Dies erschwert es, die jeweiligen Funktionen bei intakten Staphylokokken zu untersuchen. Mittels einer Doppelmutante und selektiver Komplementierung charakterisieren wir die isolierte Rolle der jeweiligen Proteine bei der Adhärenz intakter Kokken. Erste Daten deuten auf eine komplexe Interaktion der S. aureus-Zellwand mit einzelnen Matrixproteinen hin und damit auch mit Matrix-Suprastruktur. Diese Arbeiten werden in Zusammenarbeit mit Uwe Hansen und Peter Bruckner (Institut für Physiologische Chemie und Patobiochemie) und der Arbeitsgruppe Mathias Herrmann (Homburg/Saar) durchgeführt. Außerdem wirkt Eap als Immun-Modulator, indem es die Interaktion von ICAM-1 mit b2-Integrinen stört. (Studien siehe auch Forschungsbericht-Punkt zum Thema "Identifizierung und molekulare Charakterisierung von S. aureus-Genen")

Drittmittelgeber:

DFG: SFB 492, Projekt B9; DFG: Schu 1180/2-1; IZKF Münster, Projekt C20; IMF SI 410230; IMF KA 110123

Beteiligte Wissenschaftler:

Dr. med. Bhanu Sinha, PhD Muzaffar Hussain, Dr. med. Bettina Haslinger-Löffler, Dr. rer. nat. Petra Becker, Dr. med Barabra Kahl, Dr. rer. nat. Christine Heilmann, Dipl.-Biol. Matthias Grundmeier, cand. med. Cornelia Werbick, PD Dr. Karsten Becker, Prof. Dr. C. von Eiff, Univ.-Prof. Dr. Mathias Herrmann, Univ.-Prof. Dr. med. Georg Peters

Veröffentlichungen:

Bantel H*, Sinha B*, Domschke W, Peters G, Schulze-Osthoff K, Jänicke RU. a-toxin is a mediator of Staphylococcus aureus-induced cell death and activates caspases via the intrinsic death pathway independently of death receptor signaling. Journal of Cell Biology, 2001; 155:637-648. (* equally shared authorship)

Hussain M, Becker K, von Eiff C, Schrenzel J, Peters G, Herrmann M (2001) Identification and characterization of a novel 38.5-kilodalton cell surface protein of Staphylococcus aureus with extended-spectrum binding activity for extracellular matrix and plasma proteins. J Bacteriol 183:6778-6786.

Hussain M, Becker K, von Eiff C, Peters G, Herrmann M (2001) Analogs of Eap protein are conserved and prevalent in clinical Staphylococcus aureus isolates. Clin. Diagn. Lab Immunol. 8:1271-1276.

Chavakis T, Hussain M, Kanse S, Peters G, Bretzel RG, Flock JI, Herrmann M, Preissner KT (2002) Staphylococcus aureus extracellular adherence protein (Eap) serves as anti-inflammatory factor by inhibiting the recruitment of host leukocytes. Nat. Med. 8:687-693.

Sinha B, Bantel H, Schulze-Osthoff K, Peters G. Staphylococcus aureus induced apoptosis in human T-cells (Jurkat) does not require whole bacteria. 101st General Meeting American Society of Microbiology, May 20-24, 2001, Orlando, Fla, USA. (GM01-A-34953-ASM; poster D-47)

Herrmann M, Hussain M, Sinha B, Haggar A, Flock JI, Chavakis T, Preissner KT, Peters G. Extracellular secreted proteins of Staphylococcus aureus: Putative role in endovascular infection. Pathophysiology of the Endothelium: Vascular and Infectious Diseases, May 24-26, 2001, Giessen, Germany. (poster)

Que Y-A, Haefliger J-A, Francois P, Piu S, Sinha B, Entenza J-M, Vouillamoz J, Herrmann M, Vaudaux P, Moreillon P. Expression of Staphylococcus aureus Fibronectin-Binding Protein A (FnBPA) mediates bacterial internalization by endothelial cells in vitro and in rats with experimental endocarditis (EE). 41st Interscience Conference on Antimcrobial Agents and Chemotherapy, December 16-29, 2001, Chicago, Il, USA. (abstract B-782, poster)

Haslinger B, Strangfeld K, Schulze-Osthoff K, Peters G, Sinha B. Endogenous Tumor Necrosis Factor-a enhances Staphylococcus aureus a-toxin-induced apoptosis in peripheral blood mononuclear cells. 42nd Interscience Conference on Antimcrobial Agents and Chemotherapy, September 26-30, 2002, San Diego, Ca, USA. (abstract 4750, poster B-947)

Hussain M, von Eiff C, Sinha B , Peters G, Herrmann M, Becker K. A new possible tool for S. aureus identification: eap and emp genes coding for surface-associated proteins. 54th Meeting of the Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, October 06-10, 2002, Heidelberg, Germany. (abstract MPP01, poster)

Hussain M, Hansen U, Robenek H, Bruckner P, Herrmann M, Peters G, Sinha B. The Staphylococcus aureus broad specificity matrix-binding proteins Eap and Emp bind to soluble matrix and plasma proteins, and to native human matrix suprastructure. 2nd Matrix Symposium, October 10-12, 2002, Münster, Germany. (poster 9)

Sinha B, Haslinger B, Strangfeld K, Schulze-Osthoff K, Peters G. Alpha-toxin-induced apoptosis is enhanced by Tumor Necrosis Factor (TNF). 10th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, October 15-19, 2002, Tsukuba, Japan. (abstract 225-02, poster)

Becker P, Grundmeier M, Heilmann C, Peters G, Herrmann M, Sinha B. An S. aureus clpC mutant displays reduced invasiveness for host cells but normal biofilm formation. 10th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, October 15-19, 2002, Tsukuba, Japan. (abstract 225-03, poster)

Hussain M, von Eiff C, Sinha B , Peters G, Herrmann M, Becker K. Genes coding for broad binding activity cell surface associated proteins Eap and Emp as targets for S. aureus identification: studies with non-aureus staphylococci. 10th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, October 15-19, 2002, Tsukuba, Japan. (abstract 232-0, poster)

Couzinet S, Sinha B, Demaurex N., Lew D., Zimmerli S., Schrenzel J. Characterization of Staphylococcus aureus intracellular fate in non-professional phagocytes. 10th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, October 15-19, 2002, Tsukuba, Japan. (abstract 313-02, poster)