Biosynthese von Polyestern

Im Arbeitskreis werden physiologische, biochemische und molekulare Grundlagen von Stoffwechselleistungen meist von Bakterien untersucht. Schwerpunkte bilden Untersuchungen zur mikrobiellen Synthese und zur biotechnologischen Produktion von technisch relevanten Biopolymeren. Hier kommt auch der Bereitstellung von ausreichenden Mengen neuer Biopolymere eine große Bedeutung zu, um die technischen Eigenschaften und Materialeigenschaften solcher Biopolymere in Zusammenarbeit mit anderen Instituten und Einrichtungen in Kooperation untersuchen zu können. Ein weiterer Schwerpunkt sind Untersuchungen zum biologischen Abbau von Biopolymeren und synthetischen Polymeren. Daneben werden in weiteren Schwerpunkten die Biosynthese und auch der Abbau niedermolekularer Verbindungen, wie z. B. Aromastoffe, Speicherlipide und Wachsester untersucht.

In beinahe allen Schwerpunkten wird angestrebt, die hierbei gewonnenen Erkenntnisse zur Etablierung neuer oder verbesserter biotechnologischer Verfahren zu nutzen. Die Untersuchungen sollen dazu beitragen, nachwachsende Rohstoffe, Abfall- und Reststoffe der chemischen Industrie oder der Landwirtschaft, interessante Inhaltsstoffe von Pflanzen sowie auch fossile Rohstoffe mit Hilfe biotechnologscher Verfahren in für die Industrie interessante Produkte zu überführen oder zu einer sinnvollen Entsorgung von Industrieprodukten und Produkten des täglichen Lebens beizutragen.

Seit ca. 12 Jahren wird in der Arbeitsgruppe die Biosynthese wasserunlöslicher, aus Hydrofettsäuren aufgebauten Polyester (PHF) untersucht. Als Modellorganismen dienen Ralstonia eutropha, Rhodococcus ruber, anoxygene phototrophe Bakterien (z.B. Chromatium vinosum) und oxygene phototrophe Bakterien (z.B. Synechocystis sp.) Diese Untersuchungen haben wesentlich zur Aufklärung von Biosynthesewegen der PHF und zur Entdeckung neuer Bausteine von PHF sowie zur Klonierung und Ermittliung der Primärstrukturen des Schlüsselenzyms PHF-Snythase aus mittlerweile ca. 50 Bakterien beigetragen. Mittlerweile werden auch detaillierte Untersuchungen zur Aufklärung von Struktur-Funktionsbeziehungen von PHF-Synthasen und anderer, an Synthese und Akkumulation von PHF beteiligten Proteine durchgeführt. Einen breiten Raum nimmt das "metabolic engineering" ein. Hierdurch soll ein Metabolitenfluß ausgehend von Abbauprodukten einfacher, preiswerter Kohlenstoffquellen in Richtung der Biosynthese von PHF ermöglicht und optimiert werden. Ziel ist es, möglichst viele unterschiedliche PHF aus wenigen Kohlenstoffquellen herstellen zu können.

In der Arbeitsgruppe wurden auch Verfahren zur in vitro Synthese von PHF mit Hilfe isolierter Enzyme durchgeführt. Dies betrifft PHF aus kurzkettingen Hydroxyfettsäuren ebenso wie PHF aus langkettigen Hydroxyfettsäuren. Besondere Aufmerksamkeit gilt der Rezyklisierung der an den Umsetzungen beteiligten Coenzyme.

Die Untersuchungen zielen auch darauf ab, nachwachsende Rohstoffe oder davon abgeleitete Verbindungen wie Lävulinsäure und Biodiesel, Rest- und Abfallstoffe wie z. B. Melasse sowie Braunkohlen in PHF zu überführen, die als neue, biologisch abbaubare Werkstoffe eingesetzt werden können. In Bioreaktoren bis zu 500 L Nutzvolumen werden Polymermuster zur Ermittlung der Materialeigenschaften durch hieran interessierte Kooperationspartner produziert.

Im Rahmen eines durch das BML unterstützten Projektes werden Pflanzengenetikern die Gene für PHF-Biosynthese aus Bakterien zur Verfügung gestellt. Ziel ist es, diese Gene in Pflanzen zu übertragen und zu exprimieren, um zukünftig transgene Pflanzen für die Produktion von PHF aus CO₂ und durch Sonnenenergie zu erhalten. Hierzu müssen die bakteriellen Gene und deren Genprodukte charakterisiert werden.

Drittmittelgeber:

DFG, BMBF, BML, Deutsche Forschungsanstalt für Luft- und Raumfahrt, Max-Buchner Forschungsstiftung, Fonds der chemischen Industrie, EU, Monsanto (St. Louis, USA)

Beteiligte Wissenschaftler:

Prof. Dr. Alexander Steinbüchel, Dr. Dirk Fabritius, Dr. Bernd Füchtenbusch, Dr. Volker Gorenflo, Dr. Silke Hein, Dr. Ralf Jossek, Dr. Matthias Liebergesell, Dr. Shuangjiang Liu, Dr. Jürgen Paletta, Dr. Bernd H.A. Rehm, Dr. Hai Tran, Dipl.-Ing. Herbert Ahlers, Dipl.-Biol. Christian Brämer, Dipl.-Biol. Kerstin Brandt, Dipl.-Chem. Silke Fiedler, Dipl.-Biol. Stephanie Grote, Dipl.-Biol. Tina Lütke-Eversloh, Dipl.-Biol. Markus Pötter, Dipl.-Biol. Karsten Rose, Dipl.-Biol. Patricia Spiekermann, Christian Ewering, Frank Reinecke, Prof. Dr. R. Antonio, Prof. Shuishan Song, Amro Amara, Khaled El-Banna, Francis Hezayen, Qingsheng Qi, Filomena de Andrada Rodrigues

Veröffentlichungen:

Hoppensack, A., B.H.A. Rehm, A. Steinbüchel: Analysis of 4-phosphopantetheinylatin of polyhydroxybutyrate synthase from Ralstonia eutropha: generation of b-alanine auxotrophic Tn5 mutants and cloning of panD gene region, J. Bacteriol. 181:1429-1435, 1999

Spiekermann, P., B.H.A. Rehm, R. Kalscheuer, D. Baumeister, A. Steinbüchel: A sensitive, viable colony staining method using Nile Red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage cojmpounds, Arch. Microbiol. 171:73-78, 1999

Song, S., S. Hein, A. Steinbüchel: Production of poly(4-hydroxybutyric acid) by fed-batch cultures of recombinant strains of Escherichia coli, Biotechnol. Lett. 21:193-197, 1999

Gödde, C., M. Liebergesell, A. Steinbüchel: Isolation of poly(b-L-malic acid) degrading bacteria and purification and characterization of the PMA hydrolase from Comamonas acidovorans strain 7789, FEMS Microbiol. Lett.: 173:365-372, 1999

Klein, J., D.E.A. Catchside, R. Fakoussa, L. Gazso, W. Fritsche, M. Höfer, F. Laborda, I. Margarit, H.-J. Rehm, M. Reich-Walber, W. Sand, S. Schacht, H. Schmiers, L. Setti, A. Steinbüchel: Biological processing of fossil fuels, Résumé of the Bioconvension Session if ICCS'97, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:2-15, 1999

Füchtenbusch, B., A. Steinbüchel: Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates from low-rank coal liquefaction products by Pseudomonas oleovorans and Rhodococcus ruber, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:91-95, 1999

Gorenflo, V., A. Steinbüchel, S. Marose, M. Rieseberg, T. Scheper: Quantification of bacterial PHA by Nile Red staining, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:765-772, 1999

Valentin, H.E., P.A. Berger, K.J. Gruys, M.F. de A. Rodriguez, A. Steinbüchel, M. Tran, J. Asrar: Polyhydroxyalkanoate accumulation by Burkholderia sp., Macromolecules 32:7389-7395, 1999

Lütke-Eversloh, T., A. Steinbüchel: Identification and molecular characterization of a succinate semialdehyde dehydrogenase gene involved in the catabolism of 4-hydroxybutyrate in Ralstonia eutropha, FEMS Microbiol. Lett. 181:63-71, 1999

Rehm, B.H.A., A. Steinbüchel: Biochemical and genetic analysis of PHA synthases and other proteins required for PHA synthesis, Int. J. Biol. Macromol. 25:3-19, 1999

Jossek, R.: In vitro Synthese von Poly(3-Hydroxybuturat), Dissertation Universität Münster, 1999

Gorenflo, V.: Entwicklung und Optimierung eines Produktionsverfahrens zur Herstellung 4HV-haltiger Biopolyester im Pilotmaßstab, Dissertation Universität Münster, 1999

Lütke-Eversloh, T.: Biochemische und molekulargenetische Untersuchungen zum Stoffwechsel von 4-Hydroxybuttersäure in Alcaligenes eutrophus, Diplomarbeit Universität Münster, 1999

Spiekermann, P.: Veränderung der Eigenschaften von PHF-Synthasen durch Anwendung molekulargenetischer Methoden, Diplomarbeit Universität Münster, 1999

Brämer, C.: Molekulargenetische Charakterisierung von Tn5-induzierten Lävulinat-negativen und Lävulinat-leaky Mutanten von Ralstonia eutropha HF39 und Klonierung der am Abbau von Lävulinat beteiligten Gene, Diplomarbeit Universität Münster, 1999

Rose, C.: Klonierung der Orotidine-5'-monophosphat Decarboxylase aus Aureobasidium pullulans, Diplomarbeit Universität Münster, 1999

Antonio, R.V., A. Steinbüchel, B.H.A. Rehm: Analysis of in vivo substrate specificty of the PHA synthase from Ralstonia eutropha: Formation of novel copolyesters in recombinant Escherichia coli, FEMS Microbiol. Lett. 182:111-117, 2000

Liu, S.-J., A. Steinbüchel: A novel genetically engineered pathway for synthesis of poly(hydroxyalkanoic acids) in Escherichia coli, Appl. Environ. Microbiol. 66:739-743, 2000

Füchtenbusch, B., D. Wullbrandt, A. Steinbüchel: Production of polyhydroxyalkanoic acids by Ralstonia eutropha and Pseudomonas oleovorans from waste oil remaining from the production of rhamnose as sole carbon source, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:167-172, 2000

Hoffmann, N., A. Steinbüchel, B.H.A. Rehm: The Pseudomonas aeruginosa phaG gene product is involved in the synthesis of polyhydroxyalkanoic acids consisting of medium-chain-length constituents from non-related carbon sources, FEMS Microbiol. Lett. 184:253-260, 2000

Rose, K., M. Liebergesell, A. Steinbüchel: Molecular analysis of the Aureobasidium pullulans URA3 gene encoding orotidine-5'-phosphate decarboxylase and isolation of mutants defective in this gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:296-300, 2000

Hai, T., H. Ahlers, A. Steinbüchel: Axenic cultivation of anoxygenic phototrophic bacteria, cyanobacteria and microalgae in a new closed tubular glass photobioreactor, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:383-389, 2000

Clemente, T., D. Shah, M. Tran, D. Stark, S. Padgette, D. Dennis, K. Brückener, A. Steinbüchel, T. Mitsky: Sequence of PHA synthase gene from two strains of Rhodospirillum rubrum and In vivo substrate specificity of four PHA synthases across two heterologous expression systems, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:420-429, 2000

Rodrigues, F., H.E. Valentin, P.A. Berger, M. Tran, J.M. Asrar, K. Gruys, A. Steinbüchel: Polyhydroxyalkanoate accumulation in Burkholderia sp.: a molecular approach to elucidate the genes involved in formation of two distinct shortchain homopolymers, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:453-460, 2000

Liu, S.-J., A. Steinbüchel: Exploitatin of butyrate kinase and phosphotransbutyrylase from Clostridium acetobutylicum for the in vitro biosynthesis of poly(3-hydroxyalkanoic acids), Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:545-552, 2000

Song, S., S. Hein, A. Steinbüchel: Cloning, nucleotide sequence and primary biochemical characterization of esterase EstA from Ralstonia eutropha CH34, Biotechnol. Lett. 22:443-449, 2000

Fiedler, S., A. Steinbüchel, B.H.A. Rehm: PhaG-mediated synthesis of poly(3-hydroxyalkanoates) consisting of medium-chain-length constituents from non-related carbon sources in recombinant Pseudomonas fragi, Appl. Environ. Microbiol. 66:2117-2124, 2000

Qi, Q., A. Steinbüchel, B.H.A. Rehm:In vitro synthesis of poly(3-hydroxyalkanoate): purification of type II polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1 and PhaC2 from Pseudomonas aeruginosa and development of an enzyme assay, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:37-43, 2000

Liebergesell, M., S. Rahalkar, A. Steinbüchel: Analysis of the Thiocapsa pfennigii polyhydroxyalkanoate synthase: subcloning, molecular characterization and generation of hybrid synthases with the corresponding Chromatium vinosum enzyme, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:186-194, 2000

Hezayen, F.F., B.H.A. Rehm, R. Eberhardt, A. Steinbüchel: Polymer production by two newly isolated extremely halophilic archaea: Application of a novel corrosion-resistant bioreactor, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:319-325, 2000

Hoffmann, N., B.H.A. Rehm, A. Steinbüchel: Holomogous functional expression of cryptic phaG from Pseudomonas oleovorans establishes the transacylase-mediated polyhydroxyalkanoate biosynthesis pathway, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:665-670, 2000

Rodrigues, F.M. de A., E.J. Vicente, A. Steinbüchel: Studies on PHA accumulation in a polyhydroxyalkanoate synthase-negative mutant of Burkholderia cepacia generated by homogenotization, FEMS Microbiol. Lett. 193:179-185, 2000

Steinbüchel, A., I. Voß, V. Gorenflo: Interesting carbon sources for biotechnological production of biodegradable polyesters: the use of rape seed oil methyl ester (biodiesel), ACS Symposium Series 764 "Polymers from Renewable Resources. Biopolyesters and Biocatalysis" (eds. C. Scholz and R.A. Gross), Oxford University Press, pp. 14-24, 2000

Drewlo, S.: Gefärbte Einschlüsse in rekombinanten Stämmen von Escherichia coli mit Genen aus Ralstonia eutropha HF39, Diplomarbeit Universität Münster, 2000

Hoffmann, N.: Klonierung und Charakterisierung phaG homologer Gene aus Pseudomonaden der rRNA-Homologiegruppe I, Diplomarbeit Universität Münster, 2000