Funktionelle Genetik von S. aureus in Biofilmpopulationen, Interaktion mit endovaskulären, eukaryonten Adhäsiv-Proteinen und Expressionsanalyse des S. aureus SCV-Phänotyps; Interaktion von S. epidermidis mit extrazellulären Matrixproteinen

1. Funktionelle Genetik von Staphylococcus aureus in Biofilmpopulationen: Vergleich der Genexpression durch Amplifikations-gestützte Subtraktionstechniken:

   Der Krankheitserreger Staphylococcus aureus besitzt die Fähigkeit an eine Vielzahl von Oberflächen einen Biofilm auszubilden. Solche im Biofilm lebende Zellen unterscheiden sich deutlich von den in Flüssigkultur wachsenden S. aureus Zellen. Sie zeichen sich durch einen erhöhten Zell-Zell-Kontakt, einen reduzierten Metabolismus, eine reduzierte Proliferation und durch eine phänotypische Resistenz gegenüber eine große Anzahl an Antibiotika aus. Dies stellt insbesondere ein bedeutendes Risiko bei Biofilm bedingten Fremdkörperinfektionen dar. Dieser Biofilm-Phänotyp könnte unter anderem auf Unterschiede in der Gen-Expression zurückgeführt werden. Um dieses zu verifizieren wurde die cDNA-Subtraktionsmethode, Mikro-RDA, für dieses System Biofilm / planktonische S.aureus Populationen in unserem Labor etabliert. Bisher konnten für dieses System fünf differentiell exprimierte Gene identifiziert werden: das Treonyl-tRNA Synthetase Gen, das Triosephosphat Isomerase Gen, das Phosphogluceratmutase Gen, das Alkohol-Dehydrogenase Gen und das Gen für die clpC-ATPase. Mit Hilfe von Northern Analysen konnten diese Ergenisse erhärtet werden.

2. Interaktion von Staphylococcus aureus mit endovaskulären, eukaryonten Adhäsiv-Proteinen: Charakterisierung der S. aureus-von Willebrand Faktor (vWF) Bindung sowie beteiligter Rezeptorproteine und Bindungsdomänen:

   Einer der wichtigsten Schritte in der Pathogenese intravaskulärer Infektionen ist die Anbindung zirkulierender Mikroorganismen an Liganden der subendothelialen Matrix. In Vorarbeiten konnten wir durch Adhäsionsstudien mit verschiedenen Staphylococcus aureus-Stämmen die spezifische Bindung von S. aureus an vWF, einem multimerisierten, multifunktionellen Plasma- und subendothelialen Glykoprotein mit besonderer Bedeutung bei der Thrombozytenimmobilisierung nach Endotheltrauma, nachweisen. Im laufenden Forschungsprojekt konnten wir durch Analyse von Lysostaphin-Lysaten verschiedener vWF-bindender S. aureus-Stämme Western-Liganden-Blots ein einziges durch vWF erkanntes S. aureus-Adhäsin von 50-55 kDa identifizieren und durch aminoterminale Sequenzierung sowie den Einsatz von spezifischen Antikörpern/Bindungsstudien als Protein A nachweisen. Mittels Epitop-Mapping gelang es in weiteren Experimenten, eine vWF-bindende Aminosäuresequenz in der E-Domäne von Protein A zu identifizieren, bei der ein Phenylalaninrest für die Interaktion mit von Willebrand Faktor essentiell zu sein scheint. Die gefundene Wechselwirkung dieser Sequenz mit vWF konnte zudem in "Surface-Plasmon-Resonance"- Bindungstudien belegt werden. Diese Untersuchungen sichern zum ersten Mal Protein A als S. aureus-Adhäsivprotein und stellen damit die potentielle Grundlage zur Entwicklung von neuen (antiadhäsiven) Strategien zur Prophylaxe und Therapie endovaskulärer S. aureus-Infektionen.

3. Chronisch-persistierende Staphylokokkeninfektionen: Expressionsanalyse des S. aureus 'small colony variant' (SCV) Phänotyps:

   Chronisch persistierende Verlaufsformen von S. aureus Infektionen wie zum Beispiel die Osteomyelitis, die Endokarditis und die chronische Kolonisierung/Infektion des Bronchialsystems bei cystischer Fibrose werden mit einer atypischen, als SCV imponierende S. aureus Variante assoziiert. SCV sind gekennzeichnet durch langsames Wachstum, makroskopisch kleine Kolonien, reduzierte Pigmentbildung, reduzierte Bildung von a-Toxin und anderen Exoproteinen sowie einen Auxothrophismus für Hämin, Menadion, Bestandteilen der Atmungskette, sowie Thymidin. In diesem Projekt werden die Charakteristika der Genexpression von klinischen S. aureus Isolaten mit 'small colony variant' Phänotyp im Vergleich zu isogenen Isolaten mit normalem Phänotyp untersucht. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen einen signifikanten Unterschied im Expressionsprofil dieser Varianten, wobei Hinweise dafür bestehen, daß dem Streßfaktor SigB sowie den unter partieller SigB-Kontrolle stehenden Regulatoren agr und sar besondere Bedeutung in der differentiellen Expression unterschiedlicher Effektor-Transkripte für Virulenz- und Adhäsionsmoleküle in klinischen SCV Isolaten zukommt.

4. Interaktion von S. epidermidis mit extrazellulären Matrixproteinen:

   S. epidermidis ist ein häufiger Verursacher nosokomialer Infektionen, die mit der Verwendung von Plastikpolymermaterialien wie intravenösen Kathetern oder prothetischem implantierten Material assoziiert sind. Während für S. aureus eine Reihe zellwandgebundener Rezeptormoleküle (Adhäsine), die die Bindung an eukaryonte Substrate vermitteln, gefunden werden konnten, sind diese zu einem großen Teil für S. epidermidis noch nicht bekannt. Unter Verwendung von Standard-Oberflächenprotein-Extraktionsassays konnten wir S. epidermidis-Proteine mit Matrixprotein-bindenden Eigenschaften nachweisen. Ein Teil dieser Proteine (Ornithin-Carbomoyl-Transferase) wurde jedoch in der präparativen Anwendung dieser Assays aus dem intrazellulären Milieu freigesetzt und steht für die Bindung intakter S. epidermidis Zellen wohl nicht zur Verfügung. Hier konnte jedoch kürzlich S. epidermidis Zellwand-Teichonsäure als Adhäsivmolekül zur Interaktion mit Fibronektin gesichert werden, und diese Untersuchungen legen nahe, daß auch in in vivo Situationen die Bindung von Teichonsäure zur Adhäsion von S. epidermidis an Fibronektin-adsorbierte Polymeroberflächen beiträgt.

Drittmittelgeber:

DLR Projektträger des BMBF, 1997-2000; Az: 01KI9750/9; DFG Schwerpunkt- Programm "Ökologie bakterieller Krankheitserreger". Az. HE1850/2-1; 1998-2000; DFG SFB 293, Projekt A6; 1996-2002; IKF Münster; Projekt C8; 1998-2001

Beteiligte Wissenschaftler:

Prof. Dr. med. Mathias Herrmann, PhD Muzafar Hussain, Dr. rer. nat. Christine Heilmann, Dr. rer. nat. Jörg Hartleib, Petra Becker, Gunnar Belling, HďDoz. PD Dr. med. Christof von Eiff, Prof. Dr. med. Georg Peters

Veröffentlichungen:

Francois, P.P., K.T. Preissner, M. Herrmann, R.P. Haugland, P. Vaudaux, D.P. Lew, K.H. Krause: Vitronectin interaction with glycosaminoglycans. Kinetics, structural determinants, and role in binding to endothelial cells (1999). J. Biol. Chem. 274: 37611-37619.

Hussain, M., G. Peters, G.S. Chhatwal, M. Herrmann: A lithium chloride-extracted, broad-spectrum-adhesive 42-kilodalton protein of Staphylococcus epidermidis is ornithine carbamoyltransferase (1999). Infect. Immun. 67:6688-6690

Francois, P., J. Schrenzel, C. Stoerman Chopard, H. Favre, M. Herrmann, T. J. Foster, D. P. Lew, P. Vaudaux: Identification of plasma proteins adsorbed on hemodialysis tubing promoting Staphylococcus aureus adhesion (2000). J. Lab. Clin. Med. 135:32-42

Hartleib, J., N. Köhler, R.B. Dickinson, G.S. Chhatwal, J.J. Sixma, T.J. Foster, G. Peters, B.E.Kehrel, M. Herrmann: Protein A is the Von Willebrand Factor Binding Protein on Staphylococcus aureus (2000). Blood 96:2149-2156

Von Eiff, C., C. Heilmann, M. Herrmann, G. Peters: Basic aspects of the pathogenesis of staphylococcal polymer-associated infections. Infection (Suppl. 1) S7-S10 (1999)

Von Eiff, C., C. Heilmann, G. Peters: New aspects in the molecular basis of polymer-associated infections due to staphylococci. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18: 843-846 (1999)

Heilmann, C., M. Herrmann, G. Peters: Identification of a platelet-binding domain of a Staphylococcus aureus receptor exhibiting high similarity to the carbosyterminal part of the fibrinogen-binding protein FbpA. 99th General Meeting of the American Society of Microbiology, Atlanta, 1999

Köhler, N., M. Herrmann, U. Niehus, K. Jurk, J. Hartleib, G. Peters, B. Kehrel: a-granule proteins mediate platelet interaction with Staphylococcus aureus. Annals of Hematology 78 (Suppl I), abstract FV 111

Hussain, M., C. Heilmann, G. Peters, M. Herrmann: Cloning, sequencing and expression of accumulation associated protein of Stapylococcus epidermidis RP62A and complementation of mutant M7 deficient in biofilm formation. General Meeting of the American Society of Microbiology, abstract #212/B

M. Herrmann: Therapeutische Strategien. In: Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (Symposium). Deutscher Anaesthesiekongress, München 2000. Publiziert in: Anästhesiol. Intensivmed. 2000, 41: 253

G. Belling, C. Goerke, B. Kahl, C. Woltz, G. Peters, M. Herrmann: Transcriptional regulation in Staphylococcus aureus clinical small colony variants. "Microbiology 2000", München 2000. Abstract #15.K.7.03

Becker, P., W. Hufnagel, G. Peters, M. Herrmann: Biolfilm-dependent regulation of gene expression in Staphylococcus aureus. "Microbiology 2000", München 2000. Abstract #16.K.7.03

Hartleib, J., N. Köhler, B. Kehrel, S. Chhatwal, G. Peters, M. Herrmann: The E-domain is the binding site in protein A for von Willebrand factor. "Microbiology 2000", München 2000. Abstract #14.K.6.0

Hussain, M., C. Heilmann, M. Herrmann, G. Peters: Incidence of the major histocompatibility class II analog protein (MAP)/extracellular adherence protein (EAP) in clinical Staphylococcus aureus isolates. 9th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, Kolding, Denmark, 2000. Abstract #100

Hussain, M., G.S. Chhatwal, G. Peters, M. Herrmann: A novel 38.5 kDa extracellular matrix and plasma protein binding protein (Empbp) of Staphylococcus aureus: Cloning, sequencing, expression and functional characterization. 9th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, Kolding, Denmark, 2000. Abstract #98

Hartleib, J., N. Köhler, B. Kehrel, S. Chhatwal, R.B. Dickinson, J.J. Sixma, G. Peters, M. Herrmann: Von Willebrand factor - protein A interaction: Binding characteristics and binding epitope determination. 9th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, Kolding, Denmark, 2000. Abstract #96

Heilmann, C., M. Herrmann, G. Peters: Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein is involved in binding to platelets. 9th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, Kolding, Denmark, 2000. Abstract #131

Becker, P., W. Hufnagle, G. Peters, M. Herrmann: Identification of differences in regulation of gene expression in sessile versus planctonic growing populations of Staphylococcus aureus. 9th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, Kolding, Denmark, 2000. Abstract #159

Hussain, M., C. Heilmann, M. Herrmann, G. Peters: Cloning, sequencing, and expression of aap of Staphylococcus epidermidis, and complementation of mutant M7 deficient in biofilm formation. 9th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, Kolding, Denmark, 2000. Abstract #99