Teilprojekt A4 (Roth/Harms): Funktionelle Charakterisierung der kalziumbindenden Proteine MRP8 und MRP14 während der Interaktion von Monozyten mit dem Endothel

Projektleiter:	Dr. med. Johannes Roth, Univ.-Prof. Dr. med. Erik Harms
Dienstanschrift:	Klinik und Poliklinik für allgemeine Pädiatrie Albert-Schweitzer-Str. 33 48149 Münster
Telefon:	(0251) 834 7732
Telefax:	(0251) 834 7735
E-Mail:	roth@uni-muenster.de

Gemäß den Empfehlungen der Gutachterkommission waren die initial geplanten Projektteile zu funktionellen Veränderungen des submembranösen Zytoskeletts nicht Gegenstand der abgelaufenen Förderperiode dieses Teilprojektes. Die Arbeit wurde auf die Fragestellungen zu den kalziumbindenden Proteinen MRP8 und MRP14 fokussiert. Dieser Projektteil konnte in der abgelaufenen Arbeitsperiode fast vollständig erfolgreich bearbeitet werden. Zur Durchführung der nachfolgenden Experimente wurde zunächst eine Aufreinigungsmethode zur Gewinnung von nativem, humanem MRP8 und MRP14 entwickelt. Hierbei erwies sich eine Kombination aus einer Proteinfällung mit Ammoniumsulfat und eine anschließende Anionenaustauscherchromatographie als optimal. Mit dieser Methodik läßt sich jedoch ausschließlich der Komplex aus MRP8 und MRP14 reinigen, die Trennung in die beiden Einzelkomponenten erfordert weitere Schritte. Chromatographisch ist eine solche Trennung nur unter Verwendung einer 'Reversed-Phase'-Säule möglich, was jedoch zu einer irreversiblen Denaturierung der Proteine führt. Wir lösten dieses Problem durch die Etablierung einer präparativen, isoelektrischen Fokussierung (IEF) in Gegenwart von Harnstoff mit anschließender Renaturierung der Proteine in verschiedenen Dialyseschritten. Die Reinheit der Proteine beträgt rund 98%, die Ausbeuten einer Aufreinigungsprozedur liegen im Bereich von 5-10 Milligramm. Die Methodik wurde erstmals in unserer Arbeitsgruppe entwickelt und ist bereits publiziert (1). Einen weiteren Schwerpunkt des Arbeitsprogrammes bildete die Analyse der Interaktion von MRP8 und MRP14, da die kalziuminduzierte Komplexbildung dieser beiden Proteine offensichtlich eine Voraussetzung für die biologische Funktion von MRP8 und MRP14 darstellt. Zur Qualitätsanalyse unserer MRP8- und MRP14-Reinigung verwendeten wir ein massenspektrometrisches Verfahren (UV-MALDI-MS, Ultraviolett Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry). Dieses Verfahren erlaubt eine exakte Bestimmung des Molekulargewichtes der zu analysierenden Proteine. Bislang konnten jedoch für diese Methodik keine Bedingungen definiert werden, unter denen nichtkovalente Protein-Proteinwechselwirkungen stabil bleiben. Interessanterweise fand sich unter Zugabe von Kalzium zu MRP8 und MRP14 ein zusätzliches, eindeutiges Signal bei 48 kD, das exakt dem Molekulargewicht (MG) eines Tetramers aus je zwei Molekülen MRP8 und MRP14 entspricht. Von anderen Gruppen zuvor beschriebene Homodimere oder Trimere aus MRP8 und MRP14 fanden sich nicht. Der Nachweis dieser Proteinkomplexe ist von der verwendeten Matrix abhängig, in denen die Proben aufbereitet werden. Als Matrix hat sich 2,6-Dihydroxyacetophenon als optimal erwiesen wodurch Analysen unter neutralen pH-Bedingungen ermöglicht werden. Da es hier erstmalig gelungen ist, mit Hilfe der MALDI-MS eine Protein-Proteininteraktion nachzuweisen, die durch einen physiologischen Stimulus induzierbar ist, wurden diese Analysen in Erweiterung des ursprünglichen Antrages ausgeweitet. Wir konnten zeigen, daß die zwei bekannten Isoformen von MRP14, der kleineren Isoform (MRP14') fehlen die ersten vier Aminosäuren, an der Komplexbildung teilnehmen. Ebenso finden sich phosphorylierte und nicht-phosphorylierte MRP14-Moleküle in dem oben beschriebenen Tetramer. Durch die genaue Bestimmung des MG konnten posttranslationale Modifizierungen des MRP14-Moleküls charakterisiert werden. Sowohl das vollständige MRP14 wie auch MRP14' sind um das an erster Stelle codierte Methionin verkürzt und an der folgenden Aminosäure acetyliert. Zusätzlich konnten wir mit dieser Methode aufgrund einer stabilen Kalziumbindung unter den von uns gewählten Bedingungen ein kooperatives Bindungsphänomen der MRP-Komplexe für Kalzium nachweisen. Diese Ergebnisse wurden inzwischen zur Publikation eingereicht (2).

Die Charakterisierung der verschiedenen Isoformen von MRP14 sowie deren metabolische Regulation wurde in weiteren Ansätzen näher analysiert. Zuerst konnte in 'Pulse-Chase'-Experimenten durch metabolische Markierungen mit 35S-Methionin in Monozyten gezeigt werden, daß MRP14' kein Abbauprodukt von MRP14 darstellt, sondern beide Isoformen parallel translatiert werden. PCR-Analysen zeigten, daß nur eine einzige mRNA für MRP14 existiert. Da bekannt ist, daß es für MRP14 nur eine einzige genomische Kopie gibt, läßt sich aus diesen Daten folgern, daß die verschiedenen MRP14-Isoformen durch alternatives Ablesen einer einzigen mRNA an zwei verschiedenen ATG-Startcodons (Position 1 und 5) entstehen (3).

Zur weiteren Charakterisierung der strukturellen Voraussetzung der MRP8/MRP14-Komplexbildung verwendeten wir ein eukaryontisches Expressionssystem, das sogenannte 'Yeast-Two-Hybrid-System' (Matchmaker Two-Hybrid System, Clontech). Die gesamte Methodik wurde während der abgelaufenen Förderperiode vollständig in unserer Arbeitsgruppe etabliert. Das Prinzip dieser Methode beruht auf der Induktion eines Reportergens, induziert durch die Wechselwirkung zweier getrennter Domänen eines Transkriptionsfaktors. Der Hefetranskriptionsfaktor GAL4 besteht aus einer Aktivierungs- und einer Bindungsdomäne, deren räumliche Assoziation für eine erfolgreiche Geninduktion unabdingbar ist. Die cDNA beider Domänen wird bei dieser Methodik in zwei getrennten Vektoren kodiert. Zunächst wurden die cDNAs von MRP8 bzw. MRP14 zum einen mit der Bindungsdomäne, zum anderen mit der Aktivierungsdomäne von GAL4 fusioniert. Anschließend wurden Hefestämme mit verschiedenen Kombinationen von MRP8- und MRP14-kodierenden Vektoren kotransfiziert. Nur im Falle einer Interaktion der MRP8- bzw. MRP14-Anteile dieser Fusionsmoleküle führt die räumliche Annäherung der Aktivierungs- und DNA-Bindungsdomäne von GAL4 zur Expression des Reportergenes Lac-Z. In diesem eukaryontischen Expressionssystem werden die meisten posttranslationalen Modifikationen regelrecht durchgeführt und Protein-Proteinwechselwirkungen unter physiologischen in-vivo-Bedingungen analysiert. Bei diesen Experimenten ließ sich eine starke und spezifische Interaktion von MRP8 mit MRP14 nachweisen. Kotransfektionen mit zwei MRP8- bzw. MRP14-codierenden Vektoren zeigten keinerlei Hinweise auf Wechselwirkungen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den weiter oben beschriebenen Daten der MALDI-MS-Analysen und belegen, daß die von verschiedenen Arbeitsgruppen beschriebenen Homodimere von MRP8 und MRP14 offensichtlich nicht von physiologischer Relevanz sind, sondern vielmehr Aufarbeitungsartefakte darstellen. Aufgrund publizierter NMR-Daten zur Struktur von MRP8 und MRP14 wurden von einer amerikanischen Arbeitsgruppe vier konservierte Aminosäuren im MRP14-Molekül als besonders wichtig für die Interaktion mit MRP8 beschrieben. Mit Hilfe von verschiedenen Punktmutationen konnten wir die funktionelle Bedeutung von drei der vier Positionen bestätigen, während die vierte Aminosäure ausgetauscht werden kann, ohne die MRP8/MRP14-Komplexbildung zu verhindern. Durch Verwendung verschiedener Deletionskonstrukte und Mensch-Maus-Hybridmoleküle konnten wir desweiteren belegen, daß die Spezifität der MRP8/MRP14-Interaktion durch die C-terminale Helix IV des MRP14-Moleküls vermittelt wird. Diese Arbeit stellt die erste funktionelle Charakterisierung der MRP8/MRP14-Wechselwirkung unter physiologischen Bedingungen dar und ist somit eine deutliche Erweiterung der bislang publizierten, strukturellen Daten. Die Arbeit ist im Januar diesen Jahres erschienen (4). Die Komplexe aus MRP8 und MRP14 translozieren kalziumabhängig an Strukturen des Zytoskeletts und an die Plasmamembran. Die Analyse der Regulation dieser kalziumabhängigen Bindungen an Membranen und Zytoskelettfilamente stellte einen weiteren Schwerpunkt der abgelaufenen Arbeitsphase dar. Hierbei beschäftigten wir uns vornehmlich mit der Phosphorylierung von MRP14 und MRP14'. Mit Hilfe von metabolischen in-vivo-Markierungen mit 32P-Orthophosphat konnte nachgewiesen werden, daß die beiden MRP14-Isoformen zu den quantitativ bedeutensten Phosphatakzeptoren in Monozyten gehören. In einem nächsten Schritt untersuchten wir den Einfluß der MRP14-Phosphorylierung auf die intrazelluläre Lokalisation des MRP8/MRP14-Komplexes. Hierzu wurden verschiedene subzelluläre Fraktionen (Membranen, Zytoskelett, Zytoplasma), die mittels differenzieller Zentrifugation gewonnen wurden, in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Kalzium aufgereinigt und durch 2D-Elektrophoresen und anschließende Western-Blot-Analysen untersucht. Die phosphorylierten Isoformen zeigten in Gegenwart von Kalzium eine deutlich erhöhte Translokationsrate an das Zytoskelett und die Membranfraktionen verglichen mit den nichtphosphorylierten Molekülen. Da dieser Effekt einerseits durch eine direkte Wechselwirkung der phosphorylierten MRP14-Isoformen mit spezifischen Liganden bedingt sein kann, andererseits die Phosphorylierung die Kalziumaffinität dieses Moleküls erhöhen könnte und so indirekt die kalziumabhängige Translokation fördert, analysierten wir die Kalziumbindung der verschiedenen MRP-Isoformen mit Hilfe einer Kalzium-Overlay-Methode. Hierbei wird die Bindung von radioaktivem 45Kalzium nach Trennung von gereinigtem MRP8 und MRP14 mittels IEF und anschließendem Transfer auf Nitrozellulosemembranen gemessen. Mit dieser Methode fand sich einerseits eine deutlich erhöhte Kalziumaffinität von MRP14 verglichen mit MRP8. Zum zweiten zeigten die phosphorylierten Isoformen von MRP14 eine signifikant stärkere Kalziumbindung als die nichtphosphorylierten Moleküle. In Gesamtlysaten von Monozyten repräsentieren MRP8 und MRP14 rund 40% der gesamten Kalziumbindungskapazität dieser Zellen. Somit konnten wir zeigen, daß der MRP14-Untereinheit eine wichtige regulatorische Funktion im MRP8/MRP14-Komplex zukommt. Eine Regulation der Kalziumaffinität über eine Phosphorylierung wie sie von uns für MRP14 nachgewiesen wurde, ist bislang einmalig für ein Mitglied der S100-Proteinfamilie (3). Im nächsten Schritt befaßten wir uns mit der Identifizierung der Proteinkinase, die für die Phosphorylierung von MRP14 verantwortlich ist. In in-vitro-Phosphorylierungsexperimenten konnten wir zeigen, daß verschiedene Serin/Threonin-Kinasen in der Lage sind, MRP14 zu phosphorylieren. Hierzu gehören die MAP-Kinasen p38 ('mitogen activated protein kinase'), ERK I und II ('extracellular regulated kinase') und JNK ('cJun NH2-terminal kinase'), wohingegen andere Kinasen, z.B. Caseinkinase I und II, keinen Effekt ausüben. Durch den Einsatz spezifischer Aktivatoren (z. B. Arsenid für p38, Anisomycin für JNK und TPA für Proteinkinase C und ERK) und Inhibitoren (z.B. SB202190 für p38, Staurosporin für Proteinkinase C und PD98059 für ERK) konnte die MAP-Kinase p38 als einzige, physiologisch relevante Proteinkinase für die MRP14-Phosphorylierung identifiziert werden, da ausschließlich der p38-spezifische Inhibitor SB202190 die MRP14-Phosphorylierung in vitalen Monozyten hemmt. Die Phosphorylierung von MRP14 durch p38 in Monozyten führt, wahrscheinlich auf Grund der oben gezeigten Steigerung der Kalziumaffinität, zu einer Translokation des Komplexes aus MRP8 und MRP14 an die Plasmamembran, wie wir mittels Durchflußzytometrie zeigen konnten. Diese Translokation kann spezifisch durch gleichzeitige Behandlung mit SB202190 gehemmt werden. MRP14 stellt somit ein molekulares Bindeglied dar, über das die Aktivierung einer MAP-Kinase den Kalziumsignalweg in Monozyten moduliert. Eine solche Quervernetzung dieser beiden intrazellulären Signalwege konnte hiermit erstmalig gezeigt werden. Einen weiteren Arbeitsbereich dieses Teilprojektes stellte die Suche und Charakterisierung von intrazellulären Liganden von MRP8 und MRP14 dar. Bei der Reinigung von MRP8 und MRP14 aus Granulozyten findet sich ein drittes Protein, welches in bestimmten Fraktionen der Anionenaustauscherchromatographie mit diesen beiden Molekülen koeluiert wird. Dieses dritte Protein konnte durch N-terminale Sequenzierung als ein bis dahin unbekanntes S100-Protein (S100A12) identifiziert werden. Mit der Publikation dieser Daten ist uns leider eine andere Arbeitsgruppe zuvorgekommen. Mit Hilfe der Durchflußzytometrie und Immunzytologie konnten wir jedoch im Gegensatz zu anderen Arbeitsgruppen auf Einzelzellebene zeigen, daß die Expression von S100A12 in Leukozyten auf neutrophile Granulozyten beschränkt ist. S100A12 zeigt die gleiche kalziumabhängige Translokation an Zytoskelett- und Membranbestandteile wie MRP8 und MRP14. Die gemeinsame Expression in Granulozyten, die Kopurifikation und die parallele Translokation lassen eine Interaktion von S100A12 mit MRP8 und/oder MRP14 vermuten. Mittels verschiedener biochemischer Methoden wie z. B. der Dichtegradientenzentrifugation und Cross-Linking-Experimenten sowie den oben beschriebenen Methoden der MALDI-MS und dem 'Yeast-Two-Hybrid-System' konnten wir jedoch eine direkte Wechselwirkung von S100A12 mit einem der beiden anderen S100-Proteine ausschließen. Somit scheint S100A12 eine eigenständige Funktion im kalziumabhängigen Signalweg von Neutrophilen zuzukommen, die unabhängig von MRP8 und MRP14 ist. Zur Identifizierung potentieller Bindungspartner wurde zusätzlich das 'Yeast-Two-Hybrid-System' verwendet. Die cDNA von MRP8 oder MRP14 wurden mit der Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert und gegen Fusionsprodukte aus der GAL4-Aktivierungsdomäne und cDNAs einer kommerziell erhältlichen Leukozyten-Bank 'gescreent'. In diesem experimentellen Ansatz wurden jedoch positive Reaktionen für MRP8 nur gegen MRP14-Klone und für MRP14 gegen MRP8-Klone gefunden. Dieses ist wahrscheinlich einerseits auf die relativ hohe Frequenz von MRP8- und MRP14-Transscripten in der Leukozytenbank zurückzuführen. Andererseits erscheint es durchaus möglich, daß nur der MRP8/MRP14- Komplex, nicht aber die einzelnen Komponenten mit spezifischen Liganden interagieren. Solche Interaktionen lassen sich nur in einem sogenannten 'Three-Hybrid-System' testen. Ein solches System soll in der nächsten Antragsperiode etabliert werden. Die Suche nach spezifischen, intrazellulären Liganden von MRP8 und MRP14 wurde parallel mit einem anderen molekularbiologischen Ansatz verfolgt, welcher auch Liganden erfaßt, die ausschließlich von dem Komplex aus MRP8 und MRP14 erkannt werden. Hierzu etablierten wir in unserer Arbeitsgruppe das System einer Phagen-Peptidbank. Eine solche Bank enthält verschiedene Phagen ('phage f1') an deren Hüllprotein durch eine Oligonucleotidsynthese jeweils ein Nona-Peptid mit zufälliger Sequenz fusioniert wurde. Das von uns verwendete System umfaßt ungefähr 107 verschiedene Phagentypen mit unterschiedlichen Peptidsequenzen. Zum 'Screenen' von kalziumabhängigen Wechselwirkungen verwendeten wir eine Affinitätssäule, an die gereinigter Komplex aus MRP8 und MRP14 gekoppelt wurde. Zur Erhöhung der Spezifität dieser Methode wurden äußerst stringente Waschbedingungen verwendet. Phagen, die eine kalziumabhängige Bindung an die MRP8/MRP14-Säule zeigten, wurden mit EGTA eluiert und anschließend amplifiziert. Nur Phagenklone, die drei Durchläufe dieser Prozedur überstanden, wurden letztendlich zur Auswertung herangezogen. Die verschiedenen Peptidsequenzen der einzelnen Phagen wurden auf Homologien untersucht und ausschließlich diese homologen Peptidsequenzen wurden anschließend verwendet, um in verschiedenen Datenbanken nach bekannten Proteinsequenzen zu suchen. Mit dieser Methode konnten wir zwei Proteine identifizieren, die in Monozyten exprimiert werden, in den kalziumabhängigen Signalweg dieser Zellen involviert sind und somit potenzielle Liganden für MRP8 und MRP14 darstellen. Bei dem ersten Molekül handelt es sich um den MCP-1-Rezeptor (CCR2 / CC-chemokine receptor type 2). Die gefundene Homologie umfaßt eine Sequenz in der dritten intrazellulären Domäne dieses Rezeptors, der eine regulatorische Funktion in der Signaltransduktion zugeschrieben wird. Die zweite Peptidsequenz weist eine Homologie zu einer Kalzium-ATPase der Plasmamembran auf, der eine wichtige Bedeutung bei der Regulation intrazellulärer Kalziumkonzentrationen zukommt. Die genauere Analyse der Beziehungen zwischen diesen beiden Proteinen und MRP8 und MRP14 soll in der folgenden Förderperiode analysiert werden. MRP8 und MRP14 werden in relativ hohen Konzentrationen im Serum von Patienten mit entzündlichen Erkrankungen gefunden. Der Freisetzungsmechanismus dieser Proteine war bislang unbekannt, zumal keines der beiden Moleküle über eine 'Leader'-Sequenz für das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat verfügt. Wir konnten an kultivierten humanen Monozyten zeigen, daß diese Zellen MRP8 und MRP14 spezifisch sezernieren. Dieser Vorgang wird über die Aktivierung der Proteinkinase C induziert, eine direkte Phosphorylierung von MRP8 oder MRP14 ist jedoch nicht erforderlich. Die Sekretion ist ein aktiver, energieabhängiger Prozeß. Inhibitoren des klassischen Transportweges über das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat wie Monensin oder Brefeldin haben keinen Effekt auf die MRP8/MRP14- Freisetzung, was auf einen sogenannten alternativen Sekretionsweg hindeutet, wie er bereits für verschiedene andere Proteine, z. B. Interleukin-1 oder 'basic-fibroblast-growth-factor', beschrieben wurde. Im direkten Vergleich finden sich jedoch auch Unterschiede zwischen dem Freisetzungsmechanismus von MRP8 und MRP14 und dem Sekretionsweg von Interleukin-1. Diese Untersuchungen stellen die erste Charakterisierung eines Sekretionsweges für ein Mitglied der S100- Proteinfamilie dar. Die Arbeit wurde in der abgelaufenen Förderperiode bereits publiziert (5). Die Fragestellungen des Antrages wurden somit im geplanten Zeitplan bearbeitet und große Teile der erzielten Ergebnisse bereits in renomierten, internationalen Fachzeitschriften publiziert. Aufgrund dieser Vorarbeiten ergeben sich weitere interessante Fragestellungen, die in der nächsten Antragsperiode bearbeitet werden sollen.

Drittmittelgeber:

Deutsche Forschungsgemeinschaft

Beteiligte Wissenschaftler:

Dr. Johannes Roth (Teilprojektleiter), Prof. Dr. Erik Harms (Teilprojektleiter), Dipl.-Biol. Christian Pröpper (WM)

Veröffentlichungen:

van den Bos, C., A. Rammes, T. Vogl, C. Sorg, J. Roth: Co-purification of p6, MRP8 and MRP14 from human granulocytes and separation of individual proteins - 1998 - Protein Expression and Purification 13: 313

van den Bos, C., J. Roth, H.G. Koch, M. Hartmann, C. Sorg: Phosphorylation of MRP14, an S100 protein expressed during monocytic differentiation, modulates Ca(2+)-dependent translocation from cytoplasm to membranes and cytoskeleton - 1996 - J. Immunol. 156: 1247

Rammes, A., J. Roth, M. Goebeler, M. Klempt, M. Hartmann, C. Sorg: Myeloid related protein (MRP)8 and MRP14, calcium binding proteins of the S100 family, are secreted by activated monocytes via a novel, tubulin dependent pathway - 1997 - J. Biol. Chem. 272, 9496