Teilprojekt A9 (Bruckner): Entzündliche Gelenkserkrankungen: Parakrine Wechselwirkung von
Entzündungszellen mit Chondrozyten in vitro
Projektleiter: | Univ.-Prof. Dr. phil. Peter Bruckner |
Dienstanschrift: | Institut für Physiologische Chemie & Pathobiochemie Waldeyerstrasse 15, 48149
Münster |
Telefon: | (0251)
835 5591 |
Telefax: | (0251)
835 5596 |
E-Mail: | pibi@uni-muenster.de |
1. |
Kenntnisstand bei der letzten Antragstellung und Ausgangsfragestellung
Rheumatoide Arthritis ist das Ergebnis von entzündlichen Aktivitäten im Gelenk.
Für die initiale Auslösung der Pathogenese kommen viele Szenarien in Frage, aber
für die Chronifizierung ist die Aktivierung von Entzündungszellen, vorab von
Monozyten / Makrophagen kennzeichnend. Diese wandern in verschiedene Gewebsbereiche der
Gelenke ein und wechselwirken dort mit ansässigen Bindegewebszellen (z.B.
Chondrozyten, Synovialzellen). Daraus resultiert eine Aktivierung von katabolen Prozessen,
vermutlich in beiden Zellpopulationen, die zur pathologischen Gewebedestruktion führt.
Vergleichbare zelluläre Wechselwirkungen sind aber auch unter physiologischen
Bedingungen bedeutsam, z.B. beim Gewebsumbau von Knorpel in Knochen bei der
enchondralen Ossifikation. Ein Grossteil der Kontaktaufnahme der Entzündungszellen mit
den mesenchymalen Zelltypen besteht nicht in direkten Zell-Zell-Wechselwirkungen, sondern
in parakriner Kommunikation. Die löslichen Mediatoren, die die jeweiligen Zielzellen
über grosse Diffusionsstrecken erreichen, und die von diesen ausgelösten
Zellveränderungen auf molekularer Ebene sind nach wie vor nur fragmentarisch bekannt.
Die Aufklärung dieser Wechselwirkungen ist das Thema unseres Projektes. Es war schon
bekannt, dass subchondrale Blutgefässe für die Degeneration und den Abbau von
Knorpel bei der enchondralen Ossifikation essentiell sind. Deshalb interessierten wir uns
spezifisch für den parakrinen Cross-Talk zwischen Chondrozyten und primären
Monozyten / Makrophagen. Dazu hatten wir zu Beginn der Förderperiode ein geeignetes,
serumfreies Kulturmodell zu etablieren, weil Seren Entzündungsmediatoren und
chemotaktische Agentien in unbekannter Zusammensetzung enthalten, welche die
interessierenden Vorgänge nachhaltig beeinflussen. |
2. |
Angewandte Methoden
2.1 |
Zellen
Die serumfreie Monokultur von Chondrozyten stand dem Arbeitskreis bereits zur Verfügung. Diejenige
von
Monozyten war dagegen
noch zu entwickeln. Ferner wollten wir die Zelltypen in Kokultur halten, wobei die
nachfolgende Analyse der metabolischen Leistungen für jede Population auch separat
möglich zu sein hatte. Sowohl Monozyten als auch Chondrozyten können in
Agarosestabilisierten Suspensionskulturen überleben, was deren Kokultur in getrennten
Schichten derselben Petrischale ermöglicht. Diese Anordnung lässt die parakrine
Zellkommunikation zu, verhindert aber direkte Zell-Zell-Kontakte. Nach erfolgter Kokultur
können die Zelltypen wieder getrennt und einzeln analysiert werden. Auf die Verwendung
etablierter Zelllinien wurde verzichtet, weil davon ausgegangen werden muss, dass
immortalisierte Monozytenlinien sich von primären Zellen in ihrer Regulierbarkeit durch
lösliche Mediatoren wesentlich unterscheiden. Linien von differenzierten Chondrozyten
stehen als reine Zellpopulation nicht zur Verfügung. Deshalb wurden primäre
Monozyten aus Buffy Coats durch Dichtegradientzentrifugation gereinigt und in Kokultur mit
Chondrozyten gehalten (siehe 3.1). Chondrozyten wurden durch Kollagenaseverdau aus Sterna
embryonaler Hühnchen oder aus Explantaten von menschlichem Gelenks- oder
Rippenknorpel freigesetzt und in Agarosegelen kultiviert. Ausserhalb des Projektes wurden auch
serumfreie Kulturverfahren für primäre Aortenendothelzellen des Schweins sowie
menschliche Kapillarendothelzellen entwickelt (1). |
2.2 |
Proteinchemische Analysen von Matrixmakromolekülen und - Proteasen
Neusynthetisierte Knorpelkollagene wurden metabolisch mit radioaktivem Prolin
markiert, durch limitierte Pepsinbehandlung und differenzierte Salzfällung gereinigt und
durch SDS-PAGE typisiert. Mit radioaktivem Sulfat markiertes Aggrecan wurde durch
Elektrophorese in Agarose analysiert. Die Aktivität von in die Kulturmedien
ausgeschiedenen Proteasen wurde durch Zymogramme (Trennung der Proteine durch
SDS-PAGE in Substrat-haltigen Gelen) erfasst. |
2.3 |
Isolierung von RNA aus Agarosekulturen und molekularbiologische Untersuchungen
Ein wichtiger Nachteil zu Beginn der Förderperiode war, dass effiziente RNA-Isolierungsverfahren
für Agarosekulturen nicht zur Verfügung standen. Dieses Problem konnte jetzt gelöst
werden. Totale RNA wurde aus Agarosekulturen von Chondrozyten durch Extraktion mit LiCl
gewonnen. Die bis anhin schwierig zu realisierende Abtrennung der Agarose von der RNA
erfolgte zum Grossteil durch sofortige Zentrifugation der Kulturhomogenate. Danach wurde
rohe RNA durch Fällung in der Kälte durch das in den Extrakten enthaltene LiCl
über Nacht erhalten. Die weitere Reinigung der RNA erfolgte durch Phenolextraktion.
Die steadystate mRNA-Spiegel der Zellen wurden durch RNA-Blotting bestimmt (2). Bei
menschlichen Chondrozyten aus Gelenkknorpel sind die Mengen an mRNA dafür jedoch
zu gering. Deshalb wurde mit der parallelen Erfassung der mRNA-Spiegel durch RT-PCR
begonnen. |
3. |
Ergebnisse und ihre Bedeutung
3.1 |
Chondrozyten unterstützen mit parakrinen Signalen die Vitalität von Monozyten in serumfreier
Kultur
Für mindestens 4 Wochen ist die serumfreie Kultur von Monozyten aus Buffy Coats durchführbar.
Ähnlich wie Chondrozyten sind Monozyten dabei auf lösliche
Vitalitätsfaktoren angewiesen, die zwar nicht von den Monozyten selbst, aber von den
Knorpelzellen in Kokultur produziert werden. Ohne diese symbiotische Nachbarschaft sterben
Monozyten innerhalb weniger Tage durch Apoptose. Ferner sind Chondrozytensignale für
Monozyten schwach mitogen. Das Kultursystem eignet sich zur Untersuchung der gegenseitigen
Einflüsse der beiden Zelltypen, die im Folgenden beschrieben sind. |
3.2 |
Monozyten beteiligen sich nicht direkt an der Deblockierung der Spätdifferenzierung von
Chondrozyten
Nach der Chondrogenese verharren differenzierte Chondrozyten, z.B. im Gelenkknorpel, in einem Ruhezustand,
in dem sie nicht proliferieren und metabolisch wenig aktiv sind. In der Wachstumsfuge jedoch schliesst sich eine
Spätdifferenzierung an, die Proliferation von Ruhezellen und verstärkte Matrixsynthese einschliesst
und schliesslich in das Stadium der Hypertrophie mündet, charakterisiert durch die zusätzliche
Synthese von Markern wie Kollagen X und alkalischer Phosphatase. Diese
Spätdifferenzierung, die letztlich in Knorpeldegeneration und enchondraler Ossifikation
resultieren kann, verläuft spontan und unterliegt in Permanentknorpel, wie wir
kürzlich zeigen konnten (3), einer Negativkontrolle, die an mehreren Stadien über
unterschiedliche Signale eingreift (2). Da den subchondralen Blutgefässen eine
bedeutende Rolle bei der Knorpeldifferenzierung und beim Gewebsumbau in Knochen
zuerkannt wurde, stellten wir die Frage, ob Monozyten die Spätdifferenzierung in
kaudalen sternalen Hühnerchondrozyten deblockieren können. Eine solche
Aktivität wird von Endothelzellen in Form einer Proteasekaskade sezerniert (1), konnte
jedoch in Monozyten nicht gefunden werden. Dies galt sowohl für frisch isolierte Zellen,
wie auch nach deren Aktivierung durch Lipopolysaccharide (LPS). Wie unter 3.3 ff.
ausgeführt, lösen LPS sehr wohl andere Effekte aus. Folgende Zelltypen
können somit, anders als Endothelzellen, die Chondrozytenhypertrophie nicht
deblockieren: Fibroblasten, Chondrozyten aller Differenzierungsstadien, glatte Muskelzellen und
jetzt auch Monozyten. Der Sachverhalt, dass aktivierte Monozyten trotz intensiver Produktion
von Proteasen die Hypertrophie von Chondrozyten nicht deblockieren können, ist
bemerkenswert und für die Identifikation der Endothelproteasen mit diesen Eigenschaften
hilfreich. Zu klären bleibt noch, ob sich Monozyten durch Anregung von Endothelzellen
indirekt an der enchondralen Ossifikation beteiligen können. |
3.3 |
Produktion und Degradation von Kollagenen und von Aggrecan in Kokulturen von Monozyten und
Chondrozyten
Die Effektoren, die die Einflüsse der Monozyten auf die
Matrixsynthese von Chondrozyten vermitteln, scheinen Speziesspezifisch zu sein, wie mit
menschlichen Monozyten und Hühnerchondrozyten gezeigt wurde. Deshalb wurden
Versuche mit humanen Monozyten und humanen Chondrozyten vorgenommen (4), obwohl
viele Experimente mangels klinisch vergleichbarem Knorpel etwas variabel waren. Die
Monozyten übten einen geringen und vom Alter der Knorpelspender abhängigen
Einfluss auf den Kollagenmetabolismus menschlicher Chondrozyten aus. Während frisch
isolierte Chondrozyten messbare Mengen von Kollagenen produzierten, nahm die Neusynthese
schon nach kurzer Kulturdauer stark ab. Die Restmengen an metabolisch markierten
Knorpelkollagenen wurden in Gegenwart von Monozyten nur wenig, wenn überhaupt,
weiter reduziert. Dagegen fand die Aggrecansynthese noch lange Zeit auf relativ hohem Niveau
statt und wurde konsistent durch Monozyten vermindert, sowohl auf mRNA- wie auch auf
proteinchemischer Ebene. In Kokulturen mit nicht-aktivierten Monozyten trat ein Abbau des
Aggrecans in definierte Fragmente auf. Insbesondere war nach LPS-Aktivierung
Sulfat-markiertes, neusynthetisiertes Aggrecan in den Kokulturen nicht mehr nachweisbar,
während neueste, vorläufige RT-PCR-Daten belegen, dass die mRNA weiter
produziert wird, wenn auch in geringerem Umfang. Diese Beobachtungen zeigen, dass aktivierte
Monozyten in der Lage sind, nach Einwanderung in die Gelenke die Knorpelmatrixsynthese
durch direkte Beeinflussung der Knorpelzellen zu reduzieren. |
3.4 |
Produktion und Aktivierung der MMP-1 (Kollagenase) und MMP-3 (Stromelysin) in Kokulturen
Der parakrine Cross-talk zwischen Chondrozyten und Monozyten rief eine deutlich veränderte
Produktion und Aktivierung einiger Matrixmetalloproteasen hervor. Diese Veränderungen
liessen sich durch Zymographie, Immunblotting mit spezifischen Antikörpern, sowie
durch RT-PCR erfassen. Die Aktivierung von Kollagenase (MMP-1) und Stromelysin (MMP-3)
wurde in Zymogrammen oder Immunblots durch das Auftreten von Formen mit leicht
reduzierter Molmasse festgestellt. In frisch isolierten Monozyten konnte weder inaktives noch
aktiviertes MMP-1 gefunden werden. Da dieses Enzym in grossen Mengen in
polymorphkernigen Granulozyten vorkommt, konnten wir daraus schliessen, dass unsere
Monozytenpräparationen frei von diesem Leukozytentyp waren. Chondrozyten junger
Spender ergaben ebenfalls negative Befunde, während mit zunehmendem Alter
zunächst nicht-aktivierte und später auch aktivierte MMP-1 in bescheidenen und
von LPS unbeeinflussten Mengen nachweisbar waren. Die Kokultur dagegen führte zu
einer starken Vermehrung vor allem der MMP-1-Proprotease. Die Zugabe von LPS hatte eine
weitere Steigerung zur Folge und vor allem auch eine Aktivierung des Enzyms. Vergleichbare
Befunde konnten für MMP-3 erhoben werden. Generell liess sich jedoch nicht die
aktivierte Form dieses Enzyms nachweisen. Monozyten waren schwach positiv für
Pro-MMP-3, während Chondrozyten von alten (80-j.), aber nicht jungen Spendern das
Enzym in grossen Mengen produzierten. Im Gegensatz dazu war eine deutliche Steigerung des
Niveaus an Pro-MMP-3 durch Kokultur bei jungen, aber nicht alten Spendern zu beobachten.
Diese Stimulation wurde durch LPS-Aktivierung der Monozyten weiter erhöht.
Angesichts der Tatsache, dass nur Pro-MMP-3, aber nicht aktives MMP-3 auftrat, bleibt noch
offen, inwiefern dieses Enzym für den Knorpelabbau, insbesondere von Aggrecan (siehe
3.4), für Entzündungsszenarien von Bedeutung ist. In der Zukunft werden wir dem
MMP-14 unsere Aufmerksamkeit zukommen lassen, einem membrangebundenen Mitglied der
Familie von Matrixmetalloproteasen, das in vielen Systemen für die Aktivierung anderer
MMPs verantwortlich ist. Interessant ist auch der Sachverhalt, dass in Kokulturen Kollagenase
in aktiver Form produziert wird, die Degradation von neusynthetisiertem Kollagen II dagegen
eher bescheiden ist. Dies könnte sich dadurch erklären, dass gleichzeitig die
Inhibitoren TIMP-1 und 2 stimuliert werden, welche die Matrixdegradation negativ
kontrollieren. Bisher wurden von uns noch keine Erhebungen zu den TIMPs
durchgeführt. |
3.5 |
Produktion und Aktivierung der Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 in Kokulturen
Studien zu den beiden Gelatinasen MMP-2 und -9 wurden analog zu den oben
für MMP-1 und 3 beschriebenen durchgeführt. Wiederum waren Effekte in
Kokulturen zu erkennen, die durch Aktivierung der Monozyten durch LPS verstärkt
auftraten. Dies galt weniger für MMP-2 als für MMP-9. MMP-2 wurde nicht von
Monozyten aber von Chondrozyten in mehrheitlich nicht aktiver Form produziert. Die Kokultur
führte zu einer bescheidenen Steigerung, unabhängig von der Zugabe von LPS.
Diese Protease ist somit kein herausragender Kandidat als Mediator des entzündlichen
Knorpelabbaus. Anders sind die Beobachtungen mit MMP-9. Pro-MMP-9 wird von Monozyten
alleine synthetisiert, besonders in Gegenwart von LPS. Chondrozyten alleine besitzen diese
Enzymaktivität nicht, können aber interessanterweise in Kokultur Pro-MMP-9
vollständig in MMP-9 umwandeln. Da dieser Effekt nicht von LPS abhängt, ist die
wahrscheinlichste Interpretation der Befunde, dass Chondrozyten die Protease nicht selbst
produzieren, aber diejenige der Monozyten aktivieren. Damit konnten wir die Bedeutung des
Cross-Talks der beiden Zelltypen für den Matrixkatabolismus ein weiteres Mal belegen.
|
4. |
Offene Fragen
Einige wichtige Erkenntnisse über das Zusammenwirken von
Entzündungs- und Knorpelzellen konnten über unseren Ansatz gewonnen werden.
Die Kokultur von Chondrozyten und Monozyten / Makrophagen repräsentiert aber eine
vereinfachte Darstellung zellulärer Wechselwirkungen bei entzündlichen
Arthritiden. Die Rolle von Endothelzellen, möglicherweise in durch Leukozyten
aktivierter Form, wurde bisher noch nicht in die Untersuchungen mit einbezogen. Nachdem wir
im Rahmen eines anderen Projekts auch die serumfreie Kultur dieser Zelltypen etabliert haben,
wird es in der kommenden Förderperiode möglich sein, die bisherigen Studien auf
ternäre Systeme von Endothelzellen, Monozyten und Chondrozyten auszuweiten. Die
Bedeutung proteolytischer Prozesse beschränkt sich nicht, wie aus den bisherigen
Ergebnissen deutlich erkennbar, auf den Katabolismus der Knorpelmatrix, sondern kann auf die
Deblockierung der Spätdifferenzierung der Chondrozyten ausgeweitet werden, die
besonders für degenerative Gelenkserkrankungen, sowie die Entwicklung, das Wachstum
und die Reparatur von Knochen wichtig ist (siehe dazu auch Fortsetzungsantrag). Aus
ähnlichen Gründen ist ein weiteres, sich aus bisherigen Arbeiten ergebendes Thema
der Haushalt von Proteaseinhibitoren, den wir bisher noch wenig untersucht haben. Die Eignung
unseres Ansatzes auch für diese Fragestellung ist offensichtlich. Für menschliche
Zellen sind geeignete Reagenzien vorhanden und wichtige neue Ergebnisse sind zu erwarten. |
5. |
Vergleich mit Arbeiten ausserhalb des Sonderforschungsbereiches
Die Rolle von Entzündungsmediatoren und Proteasen bei entzündlichen Gelenkserkrankungen
wird weltweit auf breitester Basis erforscht und entsprechend ist auch die Zahl der Publikationen
sehr gross. Die serumfreie Kultur von Monozyten wurde aber bisher zu unserer Kenntnis noch
von keiner Forschergruppe angewendet, obwohl die Verwendung von Seren oder anderen
undefinierten Kulturzusätzen die Anwesenheit von Entzündungsmediatoren und
deren Antagonisten, sowie von Proteasen und deren Inhibitoren in unbekannter
Zusammensetzung impliziert. Häufig werden auch Chondrozyten in Monolayerkultur
untersucht. Dies besitzt zwar den Vorteil, dass die Zellen vereinfacht und direkter auf ihre
metabolische Leistungen hin untersucht werden können. Der gravierende Nachteil dieser
Kulturbedingung ist aber der instabile Knorpelphänotyp der Zellen, was die Interpretation
erschwert. Das Interesse am Matrixkatabolismus im arthritischen Knorpel beschränkt sich
nicht auf die universitäre Forschung, sondern besteht in erheblichem Umfang auch wegen
kommerzieller Gesichtspunkte. Deshalb ist der aktuelle Kenntnisstand auf diesem Gebiet nicht
leicht beurteilbar. Auch für unsere Ergebnisse muss vor deren Publikation in
wissenschaftlichen Zeitschriften die Frage der Patentierbarkeit noch geklärt
werden. | | |
Drittmittelgeber:
Beteiligte Wissenschaftler:
Veröffentlichungen:
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