Teilprojekt A6 (Herrmann/Peters/Kehrel): Interaktion von Staphylokokken mit Thrombozyten in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen: Zell- und molekularbiologische Untersuchungen

Projektleiter:	H'Doz. PD Dr. med. Mathias Herrmann, Univ.-Prof. Dr. med. Georg Peters
Dienstanschrift:	Institut für Medizinische Mikrobiologie Domagkstr. 10, 48149 Münster
Telefon:	(0251) 835 5360
Telefax:	Telefax: (0251) 835 5350
E-Mail:	herrmam@uni-muenster.de

Projektleiter:	Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Beate Kehrel
Dienstanschrift:	Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie und operative Intensivmedizin, Experimentelle und klinische Hämostaseologie Mendelstr. 11, Technologiehof, 48149 Münster
Telefon:	(0251) 835 6180
Telefax:	(0251) 835 2441
E-Mail:	Kehrel@uni-muenster.de

1.	Kenntnisstand bei der letzten Antragsstellung und Ausgangsfragestellung (1996) Die endovaskuläre Manifestation stellt aufgrund der resultierenden Bakteriämie, Sepsis und potentiellen metastatischen Erregerabsiedlung eine schwerwiegende Verlaufsform einer invasiven Staphylococcus aureus Infektion dar. Insbesondere die Staphylokokken-Endokarditis ist auch bei rechtzeitiger Diagnose und Therapie eine mit einer hohen Letalität einhergehende Erkrankung. Der erste Schritt in der Infektionspathogenese ist hierbei die Staphylokokken-Adhäsion an geschädigtes Endothel. Neben subendothelialer Matrix tragen insbesondere immobilisierte Thrombozyten zu diesen frühen pathogenetischen Ereignissen entscheidend bei, wie durch tierexperimentelle Untersuchungen bereits in den siebziger Jahren nachgewiesen werden konnte. Neben der primären Adhäsion von Staphylokokken an die Thrombozyten-Matrix kommt es jedoch auch im Bereich einer kolonisierten Herzklappe zur Bindung von Thrombozyten aus dem Blutstrom und nachfolgend zur Thrombozytenaktivierung, -aggregation und schließlich der Ausbildung einer manifesten Vegetation. In vitro geht diese Interaktion mit unterschiedlichen Phasen von Kontakt, ausgeprägter Veränderung der Thrombozytenmorphe, früher Aggregation, Degranulation mit Freisetzung von Granula-Inhaltsstoffen und schließlich irreversibler Aggregation einher. Eigene Untersuchungen ergaben, daß die Staphylokokkenadhäsion an adsorbierte Thrombozyten von der Thrombozytenaktivierung abhängig ist und in Anwesenheit von Plasmaproteinen erheblich gesteigert wird. Detaillierte Untersuchungen zur Interaktion von S. aureus, Thrombozyten und dem Einfluß spezifischer Thrombozytenaktivatoren, extrazellulärer Matrix- und Plasmaproteine sowie der Rolle spezifischer Thrombozytenrezeptoren fehlten jedoch zum Zeitpunkt der Antragsstellung weitgehend. Es wurde daher die Etablierung geeigneter in vitro-Modelle zur Analyse der Bindung von S. aureus an Plättchen im Plasmamilieu sowie an gelfiltrierte Plättchen sowohl in Suspension als auch auf der Oberfläche vorgeschlagen und die Untersuchung der beteiligten molekularen Faktoren - auf der Thrombozyten- und auf der Staphylokokkenoberfläche - geplant.
2.	Angewandte Methoden 2.1 Oberflächenadhäsionsassays Der radiometrische Adhäsionsassay wurde durchgeführt wie beschrieben (Herrmann et al. 1993). Polymethylmethacrylat (PMMA) Scheibchen (0,7x0,7 cm) wurden entweder mit Plasma- oder Thrombozytenproteinen, oder mit gelfiltrierten Thrombozyten beschichtet. Proteine wurden typischerweise für 60 min adsorbiert, Thrombozyten in Tyrode's Puffer für 15 min adhäriert, gewaschen und anschließend zur vollständigen Kontaktaktivierung für weitere 15 min inkubiert. 4 x 106 cfu [3H]-Thymidin S. aureus wurden mit den präadsorbierten PMMA-Scheibchen in Ca++/Mg++-TBS bzw. Tyrode's Puffer inkubiert (60min, 37°C), gewaschen, und adhärente Mikroorganismen im Szintillationszähler gemessen. Zur Adhäsionsmessung unter definierten Fließbedingungen wurde eine Fließzelle (kapillarer Spalt, 1,3 mm) mit zu untersuchenden Proteinen präadsorbiert, anschließend mit einem invertierten Mikroskop (Zeiss AxiovertR) mit Hilfe einer CCD-Kamera untersucht, die Videosignale mit einem frame grabber' digitalisiert und mit einer Bildanalyse-Software (OptimasR) ausgewertet. Die Verwendung eines motorgetriebenen Kreuztisches erlaubte hierbei die automatische Ansteuerung und Auswertung von multiplen Feldern. 2.2 Durchflußzytometrische Erfassung der Thrombozyten-S.aureus-Assoziate Für die Erfassung der Assoziate aus Plättchen und Bakterien wurde eine durchflußzytometrische Methode entwickelt, die die Verwendung eines Durchflußzytometers mit nur einem Anregungslaser erlaubt. Die Methodik basiert auf der Markierung der Nukleinsäuren in den Bakterien mit Syto13 (FITC-ähnliche Fluoreszenz) und Markierung der Thrombozyten mit einem monoklonalen Phycoerythrin-gekoppelten Antikörper gegen das Thrombozyten-spezifische Glykoprotein IX (GPIX). Markierte Thrombozyten (25 000/µl) und markierte Bakterien (250 000/µl) wurden durch Ultraschallbehandlung vereinzelt und für 10 Minuten koinkubiert. Nach Messung der Fluoreszenz von pro Ansatz 5 000 Partikeln wurden Assoziate als Syto13- und Phycoerythrin-positiv identifiziert. 2.3 Identifizierung von bakteriellen Oberflächen-Bindungsproteinen mit einer "phage display' Genbank 2.3.1 Konstruktion der Genbank Die Herstellung der "phage display" Genbank erfolgte weitgehend nach (Jacobsson and Frykberg, 1996). Dazu wurde chromosomale DNA des Stammes S. aureus 4074 durch Ultraschallbehandlung zufällig fragmentiert und Fragmente von ca. 200-800 bp wurden mit dem zuvor linearisierten Phagemidvektor pG8H6 ligiert. E. coli TG1 wurde mit dem Ligationsansatz transformiert und Transformanten wurden durch Ampicillin selektioniert. Nach Infektion der Transformanten mit dem Helferphagen R408 wurden Phagemid-Partikel isoliert, die theoretisch das gesamte S. aureus Genom in Fusion zu dem Gen für das Haupthüllprotein VIII des M13 Phagen enthalten und als Fusionsprotein auf der Phagenoberfläche exprimieren. Die Zahl der Transformanten war 9 x 105, wobei die durchschnittliche Größe der inserierten Fragmente 280 bp und die Insertionsrate von Fragmenten in dem Vektor 93% betrug. Die Phage display library ist daher nach Clark und Carbon (4,5 x 104 Transformanten sind erforderlich) repräsentativ für das S. aureus Genom (Clarke and Carbon, 1976). 2.3.2 "Panning" Prozedur Zur Anreicherung spezifisch an Thrombozyten bindender Phagen, wurde eine sogenannte "panning" Prozedur durchgeführt. Dazu wurden gelfiltrierte Thrombozyten in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Um unspezifische Bindungen zu blockieren, erfolgte eine Inkubation mit Hepes-Tyrodes Puffer, der 1% HSA enthielt. Anschließend wurden Aliquots der Phagenbank in Hepes-Tyrodes Puffer zugegeben. Nach 20 Waschschritten erfolgte die Elution der an Thrombozyten gebundenen Phagen mit Natriumcitrat (pH 3.7 und pH 2.1). Da S. aureus keinen Rezeptor für HSA besitzt (Jacobsson and Frykberg, 1996), wurden als Negativkontrolle Aliquots der Phagenbank zu den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zugegeben, die zuvor mit HSA beschichtet worden waren. Mit den eluierten Hybrid-Phagen wurde E. coli TG1 infiziert und nach Infektion der erhaltenen Kolonien mit dem Helferphagen R408 wurden angereicherte Phagensuspensionen gewonnen, die für eine zweite "panning" Prozedur eingesetzt wurden. 2.4 Quantifizierung der Bindung von Fibrinogen und von Willebrand Faktor an S.aureus Die Erfassung der Bindung von Fibrinogen und von Willebrand Faktor (vWF) an S.aureus erfolgte durchflußzytometrisch. VWF wurde dafür nach (Herrmann et al. 1997a) gereinigt. Die FITC-Markierung der Adhäsionsproteine erfolgte wie von uns beschrieben (Nofer et al. 1998). Bakterien wurden durch Ultraschallbehandlung vereinzelt und mit Tris-buffered saline (TBS) auf 250 000/µl eingestellt. FITC markierte Adhäsionsproteine wurden in steigenden Konzentrationen für 30 Minuten zugesetzt, die Bakterien gewaschen und die Fluorenzenz von 5000 Einzelbakterien im Durchflußzytometer gemessen. Die Quantifizierung der gebundenen Adhäsionsproteine erfolgte über eine Eichung der Fluoreszenz mit kommerziell erhältlichen Eichbeads. 2.5 Bestimmung der Aktivierung der Thrombozyten durch S.aureus Die Erfassung des Aktivierungsgrades der Thrombozyten erfolgte über die Untersuchung der Expression von P-Selektin als Marker für die ?- Granula Sekretion auf der Thrombozytenplasmamembran. Zur besseren Identifizierung mit anti GPIX-Phycoerythrin markierte Thrombozyten (25 000/µl) wurden mit S.aureus (250 000/µl) für 30 Minuten bei Raumtemperatur koinkubiert. 5000 Phycoerythrin positive Partikel pro Ansatz wurden erfasst und die Expression an P-Selektin bestimmt wie beschrieben (Kehrel et al. 1998)
3.	Ergebnisse und ihre Bedeutung 3.1 Charakterisierung der Thrombozyten-Staphylokokken - Interaktion. Die Interaktion von S. aureus mit Thrombozyten wurde sowohl in Oberflächen-Adhäsions-Assays als auch mittels einer neuen "1-Laser-Methode" in durchfluß-zytometrischen Untersuchungen evaluiert. Im radiometrischen Adhäsionsassay wurde die Adhärenz von verschiedenen S. aureus- und koagulasenegativen Staphylokokken-Isolaten sowie von einer Reihe von klinischen und Laborstämmen von Streptokokken, Enterokokken und Enterobacteriaceae untersucht. Hierbei zeigte sich, daß zwar die Adhäsion von S. aureus an Thrombozyten signifikant erhöht war, hingegen die Adhäsion von S. epidermidis-Isolaten sowie von Gruppe-A-Streptokokken, Gruppe-B-Streptokokken, Enterokokken, und E. coli-Stämmen durch oberflächengebundene Thrombozyten nicht signifikant gesteigert wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß S. aureus, jedoch nicht die übrigen getesteten Isolate (koagulase-negative Staphylokokken, Streptokokken, Enterokokken, E. coli) eine gesteigerte Adhäsion an gelfiltrierte, immobilisierte Thrombozyten aufwiesen. In Voruntersuchungen hatten wir nachgewiesen, daß Plasmaproteine die Adhäsion eines S. aureus Laborstammes (Cowan 1) erheblich steigern können. In den nun durchgeführten Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß neben S. aureus die Adhäsion von koagulasenegativen Staphylokokken und Enterokokken, nicht jedoch von Gruppe-A-Streptokokken (Stamm M2, M3, M49) oder E.coli gesteigert werden konnte. Untersuchungen mit regulatorischen Deletionsmutanten (Dsar und Dagr) sowie mit einer Koagulase(Dcoa)- und Fibrinogen-Adhäsin(Dclf)-Mutante ergaben, daß sar und coa, nicht jedoch agr und clf bei der Adhäsion an immobilisierte Thrombozyten eine Rolle spielen, was mit der Tatsache, daß coa-Expression unter sar-, jedoch nicht unter agr-Kontrolle steht, gut vereinbar ist. 3.2 Charakterisierung thrombozytärer Determinanten. Es konnte gezeigt werden, daß Plasmaproteine auch in Suspension die Bindungsrate von S. aureus an Thrombozyten steigern, und daß im Vergleich zu nicht in vitro aktivierten Thrombozyten die Interaktion von S. aureus mit Thrombin-aktivierten Plättchen signifikant erhöht war. Durch die Aktivierung verändern Proteine wie GPIIb/IIIa ihre Konformation und werden in die Lage versetzt, Plasmaproteine zu binden. GPIIb/IIIa bindet nach Aktivierung Adhäsionsproteine wie Fibrinogen, vWF, Thrombospondin und andere. Adhäsionsproteine werden aus den Granula freigesetzt und ein Teil davon bindet an die Plasmamembran zurück. Granulamembranproteine kommen durch die Verschmelzung der Granula-membranen mit der Plasmamembran an die Plättchenoberfläche. Diese Ergebnisse legen nahe, daß Fibrinogen als Brückenbildner zwischen S.aureus und Thrombozyten dienen könnte. Daher wurde der Einfluß von zwei Peptiden, die die Bindung von Fibrinogen an S. aureus und / oder Thrombozyten hemmen, ausgetestet. Das Dodecapeptid HHLGGAKQAGDV aus der gamma Kette des Fibrinogens (400-411) hemmt partiell die S.aureus-Assoziation mit aktivierten Thrombozyten, hat aber, wie erwartet, keinen Einfluß auf die Assoziation mit ruhenden Thrombozyten. RGDS führt auch zu einer partiellen Hemmung der Assoziation. Die Rolle des vWF und der Speichergranulaproteine wurde mit Hilfe von Patienten untersucht, denen diese Proteine vollständig fehlten. Die Plättchen eines Patienten mit Typ 3 von Willebrandscher Erkrankung zeigten in Suspension unter statischen Bedingungen eine normale Assoziationsrate von S. aureus. Unter diesen Bedingungen kann vWF nicht an Thrombozyten binden, was das Ergebnis erklärt. Entsprechende Untersuchungen mit aktiviertem vWF und in Suspension unter Scherstress stehen noch aus. Untersuchungen an immobilisierten Thrombozyten in Gegenwart von Plasmaproteinen in der Fließzelle bei Scherstressbedingungen zeigten jedoch deutlich die Notwendigkeit des vWF für die Assoziation. Granulaproteine sind für die S. aureus-Thrombozyten-Assoziation von besonderer Bedeutung. Die Plättchen einer von unserer Arbeitsgruppe neu diagnostizierten Patientin mit der äußerst seltenen "a-d-storage pool disease' zeigten eine deutlich erniedrigte Assoziationsrate. Die Aktivierung dieser Plättchen mit Thrombin erbrachte keine Erhöhung der Assoziationsrate. Untersuchungen mit den Plättchen von zwei Patienten mit dem äußerst seltenen Gray-platelet-Syndrom (Fehlen der a-Granula) zeigten ebenfalls eine extrem niedrige Assoziationsrate und bestätigten damit die Bedeutung der a-Granulaproteine für die Assoziation von S. aureus. CD 36-defiziente Plättchen assoziierten mit S. aureus wie gesunde Plättchen. 3.3 Charakterisierung bakterieller Determinanten 3.3.1 Radiometrischer Adhäsionsassay zur Untersuchung der S. aureus Adhäsion an Thrombozyten Zur Konstruktion einer "phage display library' wurden zunächst verschiedene Laborstämme von S. aureus sowie klinische S. aureus Isolate, die mit einer Endokarditis assoziiert waren, in einem radiometrischen in vitro Adhäsionsassay bezüglich ihrer Adhäsionsfähigkeit an immobilisierte, kontaktaktivierte Thrombozyten untersucht. Dabei zeigten die klinischen Isolate S. aureus 4074, 4075, und 4092 eine 16- bis 30-fache höhere Adhäsion an auf Polymethylmethacrylat (PMMA) Scheibchen immobilisierten Thrombozyten im Vergleich zur Negativkontrolle (nicht "gecoatete" coverslips in Anwesenheit von 0,1 % humanes Serumalbumin, HSA, zur Blockierung unspezifischer Bindung an die Polymeroberfläche). Im Gegensatz dazu führten auf PMMA-Scheibchen immobilisierte Thrombozyten nur zu einer 5- bis 13-fachen Adhäsionssteigerung bei den Laborstämmen S. aureus 6390, Cowan 1 und SA113. Aus diesem Grund wurde das klinische Isolat S. aureus 4074 als Donorstamm zur Konstruktion der "phage display library" ausgewählt. 3.3.2 Ergebnis der "panning" Experimente: Es wurden etwa 5 mal mehr Phagen eluiert, wenn das "panning" gegen immobilisierte Thrombozyten durchgeführt wurde im Vergleich zu der Negativkontrolle HSA. Das zweite "panning" mit den angereicherten Phagensuspensionen aus dem Thrombozyten-"panning" führte zu einer Elution von ca. 40-fach mehr Phagen im Vergleich zu dem ersten "panning". Diese Anreicherung ist spezifisch, da ca. 100-fach weniger Phagen eluiert wurden, wenn das zweite "panning" mit der gleichen Phagensuspension gegen HSA durchgeführt wurde. Das zweite "panning" gegen HSA mit den Phagensuspensionen aus dem HSA-"panning" führte dagegen nicht zu einer Anreicherung. Daraus ist zu schließen, daß eine spezifische Bindung von Hybrid-Phagen an Thrombozyten stattfindet, was zu einer Anreicherung an Phagen führt. Es ist keine Anreicherung zu beobachten, wenn die Bakterien keinen Rezeptor für den eingesetzten Liganden (hier HSA) besitzen. 3.3.3 Analyse der Affinitäts-selektierten Hybrid-Phagen: Die Plasmide von 88 zufällig ausgewählten Klonen, die nach dem zweiten "panning" gegen Thrombozyten gewonnen waren, wurden isoliert und analysiert. Dabei wurde festgestellt, daß einige Fragmente mehrfach isoliert wurden: 23% (20 Klone) hatten ein Insert von 1.1 kb, 11% (10 Klone) hatten ein Insert von 800 bp, 6% wiesen ein Insert von 480 bp auf, in 5% der Klone war das Insert 460 bp, in 4.5% 380 bp und in 3.4% 250 bp. Die Sequenzanalyse der mehrfach isolierten Plasmide ergab, daß Klon P43 (800 bp), Klon P33 (480 bp), Klon P27 (460 bp) und Klon P24 (380 bp) identische Nukleotidsequenzen in einem überlappenden Bereich in Fusion zu dem Gen für das Haupthüllprotein pVIII aufweisen. Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäure (AS)-Sequenzen mit den Sequenzen bekannter Proteine der SwissProt-Datenbank ergab eine hohe Ähnlichkeit mit dem C-terminalen Teil von Koagulasen und dem Fibrinogen-Bindeprotein FbpA aus S. aureus. Der Homologievergleich der abgeleiteten AS-Sequenz des Klons P43 mit dem C-terminalen Teil der Koagulase aus dem Stamm BB und 8325-4 ergab 93% bzw 85% identische AS, sowie mit dem C-terminalen Teil von FbpA 88% identische AS. Ein gemeinsames strukturelles Merkmal dieser Proteine sind die homologen C-terminalen repetitiven Sequenzen, die aus jeweils 27 As bestehen und bei der Koagulase aus dem Stamm 8325-4 und FbpA 5-fach und bei der Koagulase aus dem Stamm BB 8-fach vorkommen. Es ist bekannt, daß der C-terminale Bereich dieser Proteine die Fibrinogen-bindende Domäne enthält. Die Sequenzanalyse des 1.1 kb großen Insert repräsentiert durch Klon P22 und Vergleich der abgeleiteten AS-sequenz, die in Fusion zu pVIII vorlag, mit bekannten Proteinen aus der Datenbank ergab 100% identische AS mit dem N-terminalen Teil des Fibrinogen-Bindeproteins Fib. Der N-terminale Bereich von Fib enthält ebenfalls zwei repetitive Sequenzen von jeweils 22 AS und stellt die Fibrinogen-bindende Domäne dar. 3.3.4 Kontrolle der Bindung der Klone P43 und P22 an Thrombozyten Von den Phagemidklonen P43 und P22 sowie dem Vektor pG8H6 wurden Phagensuspensionen gewonnen. Von den Phagensuspensionen P43 und P22 wurden 1:10, 1:100 und 1:1000-Verdünnungen hergestellt. In "panning" Experimenten gegen immobilisierte Thrombozyten wurden jeweils gleiche Teile der Phagensuspension pG8H6 mit gleichen Teilen der unverdünnten und verdünnten Phagensuspensionen P43 bzw. P22 eingesetzt. Bei einem Verhältnis von 1:1 und 1:10 von pG8H6 und P43 bzw. P22 wurden zu 100% die Hybridphagen P42 bzw. P22 eluiert. Bei einem Verhältnis von 1:100 von pG8H6 und P43 bzw. P22 wurden zu 75% der Hybridphage P43 bzw. zu 50% der Hybridphage P22 eluiert. Bei einem Verhältnis von 1:1000 von pG8H6 und P43 bzw. P22 wurden zu 34% der Hybridphage P43 bzw. zu 33% der Hybridphage P22 eluiert. Diese Ergebnisse bestätigen, daß es tatsächlich zu einer spezifischen Bindung der Hybridphagen P43 bzw. P22 an Thrombozyten kommt. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, daß die Bindung von S. aureus 4074 an Thrombozyten zumindest teilweise durch die Oberflächenproteine Koagulase/FbpA bzw. Fib vermittelt wird und daß diese Bindung wahrscheinlich über Fibrinogen als Brückenmolekül vermittelt wird, da jeweils der Fibrinogen-bindende Teil dieser Proteine in Fusion zu dem Protein VIII vorliegt. 3.3.5 "panning" Experiment gegen Faktor GPIIb/IIIa und Glycocalicin Da die Rezeptoren GPIIb/IIIa und Glycocalicin (extrazellulärer Teil des GPIba) in sehr hoher Anzahl auf den Thrombozyten (80.000 bzw. 50.000 Kopien/Plättchen) vorliegen, wurde untersucht, ob es möglicherweise zu einer direkten Bindung von S. aureus an diese Rezeptoren kommt. Zu diesem Zweck wurden die von uns wie beschrieben (Kronenberg et al. 1998 Clemetson et al. 1981) gereinigten Membranglykoproteine an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte über Nacht adsorbiert und die "panning" Experimente mit der "phage display library" im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt. Dabei konnte nach dem zweiten "panning" keine Anreicherung an Phagen beobachtet werden. Da eine deutliche Anreicherung jedoch auch bei dem "panning" gegen Fibronektin ausblieb und dennoch spezifisch an Fibronektin bindende Klone identifiziert wurden, wurden Plasmide von jeweils 48 zufällig ausgewählten Klonen isoliert und analysiert. Dabei wurden mehrere Klone identifiziert, die ein Fragment der gleichen Größe enthielten. Auch nach Bestimmung der Nukleotidsequenzen der inserierten Fragmente erwiesen sich mehrere Klone als identisch. Die Sequenzanalyse ergab jedoch keine durchgehenden offenen Leserahmen in Fusion zu dem Gen VIII und der Vergleich der abgeleiteten AS-Sequenzen zu bekannten Proteinen der Datenbank ließ keine Schlüsse auf kodierende Sequenzen zu, die mit der Bindung an GPIIb/IIIa bzw. Glycocalicin in Verbindung gebracht werden könnten. Wir schließen daraus, daß vermutlich keine direkte Bindung des Stammes S. aureus 4074 an GPIIb/IIIa bzw. Glycocalicin stattfindet. Diese Ergebnisse sind auf der 98. Jahrestagung der ASM mitgeteilt worden (Heilmann et al. 1998). 3.3.6 Map als Bakterien Adhäsin Ein weiteres, von unserer Arbeitsgruppe in letzter Zeit untersuchtes S. aureus Adhäsin ist das MHCII-analoge Protein Map. In Western-Liganden-Assays konnten Bindeaktivität von Map gegenüber einer Reihe extrazellulärer Matrixproteine (Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen, Thrombospondin) nachgewiesen werden, die Rolle von Map in vitro konnte jedoch noch nicht klar festgelegt werden. Wir haben das map-Gen und seine Expression in S. aureus Newman nachgewiesen, eine Dmap-Mutante konstruiert sowie die Herstellung von rekombinantem Map unter Verwendung eines His-markierten Fusionsproteinsystems realisiert. Hiermit können wir jetzt die potentielle Rolle von Map in der Interaktion mit Thrombozyten evaluieren. 3.4 Charakterisierung von Plasmaprotein-Determinanten 3.4.1 Fibrinogen Die oben ausgeführten Ergebnisse legen eine Beteiligung des Fibrinogens an der Interaktion mit Thrombozyten nahe. Da im Gegensatz zur Bindung an Thrombozyten die Bindungsparameter der Fibrinogenbindung an S. aureus nicht gut charakterisiert sind, haben wir diese mit FITC-markiertem Fibrinogen in Bindungsstudien durchflußzytometrisch untersucht. Fibrinogen bindet dosisabhängig in einer Sättigungskinetik an S. aureus. Die Fibrinogenbindung an den Stamm Newman ist über 300fach höher als die Bindung an E.coli oder RP62A von S. epidermidis. Die Bindung von Fibrinogen an S.aureus ist spezifisch wie Verdrängungsversuche mit unmarkiertem Liganden gezeigt haben. Untersuchungen mit "clumping-factor'-negativen S. aureus Mutanten, mit koagulasenegativen Mutanten und mit Protein A-Negativmutanten legen eine Beteiligung von Protein A und "clumping factor', nicht aber von Koagulase, an der Fibrinogenbindung nahe. So wurde kein Unterschied in der Fibrinogenbindung an Wildtyp und koagulasenegative S. aureus Stämme gefunden. Die Fibrinogenbindung an die Protein A-Negativmutante von S. aureus ist bis zu 75% niedriger als die Fibrinogenbindung an den Wildtyp. Fibrinogen bindet an Clumpingfaktor negativen S.aureus vom Stamm Newman deutlich geringer, wenn die angebotene Fibrinogenkonzentration niedrig ist. Durch Erhöhung der Fibrinogenkonzentration läßt sich aber eine fast normale Zahl an gebundenen Molekülen erzielen. Das Ergebnis spricht für das Vorhandensein von mindestens zwei unterschiedlichen Bindeproteinen für Fibrinogen auf S.aureus Newman. Ein Bindeprotein mit hoher Affinität zum Fibrinogen aber niedriger Kopienzahl auf dem Bakterium (d.h. mit über dieses Protein vermittelter niedriger Bindungskapazität) könnte nach diesen Ergebnissen der Clumpingfaktor sein. Der Widtyp des Stammes 8325-4 bindet ca. 80 fach so viel Fibrinogen wie die Clumpingfaktor Negativmutante. Für 8325-4 ist der Clumpingfaktor das entscheidende Fibrinogenbindeprotein. 3.4.2 von Willebrand Faktor Zur Untersuchung der Interaktion von S. aureus mit vWF haben wir aus Kryopräzipitaten aufgereinigten vWF mit [125I] markiert oder auf Oberflächen adsorbiert, die Bindung von vWF an S. aureus in Suspension bzw. die Adhäsion [3H]-markierter S. aureus an immobilisierten vWF bestimmt und dabei für eine Reihe klinischer S. aureus-Isolate und S. aureus-Laborstämme dosisabhängige Bindungs- und Adhäsionskinetiken von vWF nachweisen können. Diese Ergebnisse wurden inzwischen publiziert (Herrmann et al., 1997a). Als weiteren Schritt haben wir das vWF-Adhäsin auf S. aureus untersucht. Hierzu haben wir zunächst in Western-Ligand Assays die Bindung von Digoxigenin-markiertem vWF an aufgetrennte Proteine aus S. aureus Ganzzellysaten untersucht. Dabei zeigte sich, daß Protein A (durch N-terminale Sequenzierung und Western-blot-Verfahren bestätigt) von vWF erkannt wird. Weitere Untersuchungen erfolgten mittels Durchflußzytometrie. Die Bindung von vWF an S. aureus war spezifisch und folgte einer Sättigungskinetik. Unterschiedliche S. aureus Stämme banden Stamm-charakteristische Mengen an vWF. Untersuchungen mit Protein-A-negativen Dspa:TcR-Mutanten unterschiedlicher Wildtypstämme (S. aureus Cowan1, 8325-4 und Newman) sowie mit spa-komplementierten Mutanten ergaben hierbei im Vergleich zum Wildtyp eine signifikante Reduktion der Bindung von vWF an die Mutante. Die Bindung von vWF an S.aureus ließ sich mit einem polyklonalen Antikörper gegen Protein A dosisabhängig inhibieren. Zusammengenommen weisen diese Befunde erstmalig nach, daß Protein A neben seiner IgG-bindendenden Funktion ein entscheidendes S. aureus Adhäsin für vWF darstellt. Diese Ergebnisse sind auf der 38. Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy mitgeteilt worden. Ein entsprechend vorbereitetes Manuskript wird in Kürze eingereicht. 3.5 Aktivierung von Thrombozyten durch S. aureus. Die Interaktion von S. aureus mit Thrombozyten führte bei einigen Blutspendern (6 von 52) zur Expression von P-Selektin auf der Thrombozytenoberfläche. Interessanterweise war die Aktivierbarkeit der Thrombozyten durch S. aureus ein spezifisches Merkmal der Blutspender. In vielfach wiederholten Testungen ergab sich, daß bei Vorliegen der Thrombozyten-Aktivierbarkeit eines Spenders durch S. aureus diese Beobachtung ausnahmslos reproduziert werden konnte. Umgekehrt ließen sich Plättchen der anderen Gruppe von Spendern ohne Aktivierbarkeit ebenso ausnahmelos nie aktivieren. Dies Ergebnis deutet darauf hin, daß der Aktivierbarkeit der Thrombozyten durch S. aureus ein Genpolymorphismus zu Grunde liegen könnte. Die Aktivierung erscheint eine FcRIIA vermittelte Reaktion zu sein, da Fab-Fragmente des inhibierenden monoklonalen Antikörpers IV.3 die S. aureus-vermittelte P-Selektin-Expression (Marker für die Freisetzung der a-Granula Speicherproteine) dosisabhängig hemmten. Für FcRIIA ist ein Genpolymorphismus bekannt, welcher die Aktivierbarkeit der Thrombozyten durch Immunkomplexe stark beeinflußt. Ob dieser Polymorphismus in Zusammenhang mit der Aktivierbarkeit der Thrombozyten durch S.aureus steht, wird zur Zeit von uns untersucht.
4.	Vergleiche mit Arbeiten außerhalb des Sonderforschungsbereiches und Reaktionen der wissenschaftlichen Öffentlichkeit auf die eigenen Arbeiten Die Interaktion von Thrombozyten mit S. aureus ist von mehreren Arbeitsgruppen zwischenzeitlich weiter untersucht worden. Unter Verwendung eines klinischen S. aureus Stammes und gewaschener Thrombozyten bestimmte Usui et al. die Bakterien-Thrombozyten-Aggregatbildung in einem Suspensions- Bindungsassay mit anschließender differentieller Zentrifugation. In verschiedenen biochemischen Ansätzen wurden darüberhinaus 14 - 16 kDa bakterielle Zelloberflächenproteine identifiziert, die mit den Thrombozyten interagierten. Die weitere Natur dieser putativen Bindungsproteine wurde nicht aufgeklärt (Usui et al. 1997). Unter Verwendung einer Transposon-Insertions-Mutagenesetechnik untersuchten Sullam et al. eine Deletionsmutanten-Bank bezüglich Bindung an inaktivierte, formolfixierte Kaninchen-Thrombozyten. Eine Mutante mit reduzierter Thrombozyten-Adhäsion (Stamm PS12) wurde identifiziert und im Endokarditismodell untersucht. Hier ergab sich, daß die Mutante eine reduzierte Virulenz aufwies (reduzíerte Infektivität und geringere Erregerkonzentrationen in Vegetationen), dies jedoch nicht aufgrund einer primär reduzierten Adhäsion an vorgeschädigte Klappen, sondern möglicherweise durch eine gestörte Fähigkeit der Mutante Blutstrom-Thrombozyten zu binden (Sullam et al. 1996). Unsere eigenen Arbeiten, die durch Bindung an immobilisierte Thrombozyten zwei Staphylokokkenadhäsine mit Fibrinogen-bindender Funktion identifiziert haben, erlauben nun, durch gezielte Deletion die Funktion dieser Adhäsine in Bezug auf die Thrombozytenbindung zu untersuchen. Die Tatsache, daß ein "panning' von immobilisiertem GPIIb/IIIa Rezeptor keine faßbar repräsentierte Adhäsin-Sequenz ergab, ist auch im Zusammenhang mit Voruntersuchungen von Bayer et al. zu sehen, nach denen die Thrombozyten-Aggregation (in Suspension) zwar die Bindung von Fibrinogen durch die Bakterien erfordert, jedoch primär nicht von den beiden wesentlichen Fibrinogen-Bindungsstellen auf dem GPIIb/IIIa-Rezeptor (der RGDS und der Dodecapeptid-Bindungsstelle) abhängig ist (Bayer et al. 1995). In weiteren Arbeiten wurden von Thrombozyten nach Aktivierung sezernierte "platelet microbicidal proteins' in Bezug auf ihre zur Bakterizidie führenden Mechanismen sowie ihre Bedeutung in der experimentellen Infektion (Endokarditismodell) untersucht. Hier zeigte sich, daß das 'target' dieser antimikrobiellen Peptide die Zellmembran ist (Koo et al. 1997), wobei die antibakterielle Aktivität unter physiologischen Bedingungen (pH, Temperatur, Osmolalität) und gegenüber Bakterien in der logarithmischen Phase optimal ist (Koo et al. 1996b) und nicht ausschließlich durch das Transmembran-Potential (wie bei anderen kationischen antibakteriellen Molekülen) bestimmt wird (Koo et al. 1996a). Darüberhinaus konnte nachgewiesen werden, daß die Resistenz von Erregern gegenüber tPMP ein Pathogenese- und Virulenzfaktor im Endokarditismodell darstellt (Dhawan et al. 1998a;Dhawan et al. 1998b). Diese Arbeiten berühren die Forschungsziele unserer Arbeiten nur insoweit, als tPMP-Suszeptibilität auch mit Adhäsion an Thrombozyten assoziiert worden ist. Ein alternatives Fibrinogen-bindendendes Protein ClfB konnte kürzlich von Eidhin et al. gesichert werden (Eidhin et al. 1998). Die Funktion dieses Moleküls wird normalerweise durch die Aktivität des ClfA-Adhäsins maskiert. Aufgrund der langjährigen Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe T. Foster (Dublin) können wir jedoch auch über entsprechende 'single' und 'double knockout' Mutanten verfügen, um die Bedeutung des ClfB in Suspension zu identifizieren. Unsere eigenen Ergebnisse sind inzwischen teilweise bereits publiziert worden (Herrmann et al., 1997a). Weitere Ergebnisse sind auf nationalen und internationalen Kongressen in begutachteten Beiträgen vorgestellt worden (Herrmann et al. 1997b;Hartleib et al. 1998) und auch teilweise in abstract-Form publiziert worden (Köhler et al. 1998). Entsprechende Manuskripte sind z.Z. in Vorbereitung.
5.	Offene Fragen Folgende Untersuchungen sind als unmittelbares Resultat der in der vergangenen Förderperiode gewonnen Ergebnisse geplant: Im Rahmen unserer Untersuchungen zur Interaktion von vWF mit Protein A arbeiten wir zur Zeit an der Identifizierung der Bindungsdomänen sowohl auf vWF als auch auf Protein A. Hier verwenden wir u.a. Methoden zum Epitop-Mapping mittels einer Peptid-Bank von Protein-A-Sequenzen sowie Deletionsmutanten von vWF (in Zusammenarbeit mit J.J. Sixma, Utrecht). Die Untersuchungen zur Interaktion von S. aureus mit Fibrinogen sollen noch durch Experimente mit weiteren Mutanten, insbesondere mit einer clf-komplementierten ?clf-Mutante ergänzt werden sowie, wie oben beschrieben, mit Untersuchungen zur Bedeutung von clfA und clfB im durchflußzytometrischen Assay. Die Identität der an der Thrombozyten-S. aureus-Assoziation beteiligten Granula-Proteine ist gegenwärtig noch nicht geklärt und soll weiter untersucht werden. Der Mechanismus der unterschiedlichen, spenderabhängigen Aktivierbarkeit der Thrombozyten durch S. aureus ist z.Zt. noch unklar. Eine Arbeitshypothese besteht in der Möglichkeit eines Polymorphismus des FcRIIA und wird entsprechend verfolgt. Die Ergebnisse und molekulargenetischen Konstrukte, die mit der 'phage display library' erhalten wurden, ermöglichen uns nun, entsprechende Phagen auch für Inhibitionsversuche einzusetzen. Darüberhinaus ist geplant, die offenen Fragen, die aus der komplexen Interaktion zwischen S. aureus, Thrombozyten und Gefäßwand resultieren, durch eine Erweiterung der Untersuchungen und Einbeziehung des Endothels entsprechend der weiteren formulierten Ziele zu bearbeiten.

Drittmittelgeber:

Deutsche Forschungsgemeinschaft

Beteiligte Wissenschaftler:

H'Doz PD Dr. med. Mathias Herrmann (Teilprojektleiter), Univ.-Prof. Dr. med. Georg Peters (Teilprojektleiter), PD Dr. rer. nat. Beate Kehrel (Teilprojektleiter), Dr. rer. nat. Christine Heilmann (WM), Tierärztin Nicola Köhler (WM)

Veröffentlichungen:

Hartleib, J., N. Köhler, R.B. Dickinson, G.S. Chhatwal, J.J. Sixma, T.J. Foster, G. Peters, B. Kehrel, M. Herrmann: Binding mechanisms of Staphylococcus aureus to von Willebrand factor: Protein A revisited. Abstracts of the 38th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (Abstract) - 1998

Heilmann, C., M. Herrmann, G. Peters: Identification of a platelet-binding domain of a Staphylococcus aureus receptor exhiting high similarity to the carboxyterminal part of the fibrinogen-binding protein FbpA. 98th General Meeting of the American Society for Microbiology, Atlanta Abstract B-32(Abstract) - 1998

Herrmann, M., J. Hartleib, B. Kehrel, R.R. Montgomery, J.J. Sixma, G. Peters: Interaction of von Willebrand factor with Staphylococcus aureus. J.Infect.Dis. 176, 984-991. - 1997

Herrmann, M., B. Kehrel, U. Hackethal, N. Köhler, R.B. Dickinson, J. Hartleib, G. Peters: Untersuchungen der Interaktion von Staphylococcus aureus mit Thrombozyten in Suspension und auf Oberflächen. Abstract-Band, 49. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (Abstract) - 1997

Köhler, N., M. Herrmann, U. Niehus, K. Jurk, J. Hartleib, G. Peters, B. Kehrel: a-granule proteins mediate platelet interaction with Staphylococcus aureus. Platelets im Druck(Abstract) - 1998