Forschungsbericht 1997-98 | |
Sonderforschungsbereich 293
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Forschungsschwerpunkte 1997 - 1998
Sonderforschungsbereiche Sonderforschungsbereich 293 Dermatologie | ||||||||||||||
Teilprojekt B1 (Grabbe/Schwarz): Untersuchungen zur Aufklärung der Effektormechanismen der allergischen Kontaktdermatitis
Das langfristig ausgelegte Ziel des vorliegenden Projekts
ist die Untersuchung der Pathophysiologie der Auslösephase des allergischen
Kontaktekzems. Hierbei bilden vor allem die Signale, die zur Auslösung einer
Ekzemreaktion führen und die daran beteiligten zellulären Elemente den
Mittelpunkt unseres Interesses. In der zurückliegenden Antragsperiode konnten
mehrere
wichtige Erkenntnisse hierzu gewonnen werden, die z.T. bereits publiziert wurden (u.a. im
Journal of Clinical Investigation, Immunology Today, Journal of Immunology, Journal of
Experimental Medicine) bzw. deren Ergebnisse in Kürze zur Publikation eingereicht
werden können. Viele der im Vorantrag im Detail beschriebenen Experimente wurden
wie
veranschlagt durchgeführt. Einige der im Erstantrag gewählten Ansätze
erwiesen sich jedoch als nicht zielführend. Anstelle dessen konnten - z.T. aufgrund
neuer
Erkenntnisse, z.T. aufgrund der Verfügbarkeit interessanter neuartiger
Untersuchungsmodelle - zusätzliche ersuchsreihen durchgeführt bzw. begonnen
werden, die sich als vielversprechend erwiesen und teilweise die Basis für diesen
Folgeantrag geschaffen haben. Der erste Arbeitsschwerpunkt des Projekts war die
Identifizierung von Faktoren, die neben der eigentlichen immunologischen Erkennung des
Allergens zusätzlich erforderlich sind, um eine Kontaktekzemreaktion in
adäquater
Weise auszulösen. In diesem Zusammenhang konnten wir zeigen, daß die
Auslösung des allergischen Kontaktekzems nicht allein durch die Anwesenheit einer
für die immunologische Erkennung ausreichenden Dosis eines Antigens bedingt ist
(Grabbe 1996). Hierbei verwendeten wir ein Untersuchungsmodell, in dem Mäuse
gegen
ein ("spezifisches") Hapten sensibilisiert wurden und anschließend das Kontaktekzem
durch Applikation einer Kombination verschiedener Konzentrationen spezifischen Haptens
zusammen mit einem zweiten, immunologisch irrelevanten Hapten ausgelöst wurde.
Durch Applikation des spezifischen Haptens in unterschwelliger Dosierung und gleichzeitige
Applikation einer Titrationsreihe eines zweiten, nicht verwandten Haptens konnte
demonstriert
werden, daß die zusätzliche Verabreichung eines zweiten Haptens in
ausreichender
Konzentration eine starke Ekzemreaktion bereits gegen sehr geringe, stark unterschwellige
Dosierungen des relevanten Haptens verursacht, sodaß also ein immunologisch
irrelevantes Hapten zur Auslösung einer spezifischen Immunantwort wesentlich
beitragen
kann. Hierbei war die Menge des spezifischen Haptens, die zur Auslösung einer
Ekzemreaktion in gegen dieses Hapten sensibilisierten Mäusen erforderlich war, im
Vergleich zur alleinigen Applikation dieses Haptens etwa 1000mal geringer, wenn
gleichzeitig
ein nicht verwandtes zweites Hapten mit aufgetragen wurde. Weiterhin zeigte sich, daß
im
Gegensatz dazu bereits eine minimale Verringerung des durch das zweite Hapten
ausgelösten unspezifischen Entzündungsreizes eine stark reduzierte
Ekzemreaktion
gegen das gleichzeitig in geringer Dosierung aufgetragene spezifische Hapten bewirkte. Wir
konnten ausschließen, daß der unspezifisch-proinflammatorische Effekt des
irrelevanten Haptens durch eine immunologische Erkennung desselben bedingt ist, da dieser
Effekt auch dann noch unvermindert vorhanden war, wenn zuvor eine Immuntoleranz gegen
dieses Hapten induziert worden war. Daraus ergibt sich, daß die starke
Dosisabhängigkeit des allergischen Kontaktekzems nicht dadurch bedingt ist,
daß
die zur immunologischen Erkennung erforderliche Antigenmenge limitiert ist, sondern
daß
eine bestimmte Menge Hapten zur Induktion einer unspezifischen
Entzündungsreaktion
erforderlich ist. Somit konnten wir zeigen, daß Allergene neben ihrer Eigenschaft, vom
Immunsystem spezifisch erkannt zu werden, noch eine zweite Eigenschaft besitzen
müssen, nämlich die Fähigkeit, eine bislang nicht näher definierte
"Irritation" bzw. Entzündungsreaktion zu verursachen. Weiterhin konnte nachgewiesen
werden, daß diese proinflammatorische Komponente eine grundsätzliche
Eigenschaft von Allergenen zu sein scheint, und daß die Art der durch sie
ausgelösten unterschwelligen Entzündungsreaktion sich von der durch
Irritanzien
verursachten Entzündung unterscheidet. Diese Befunde wurden im Journal of Clinical
Investigation publiziert. Darüberhinaus wurden zwei Übersichtsartikel hierzu
verfaßt, von denen einer (im Am. J. Contact Dermatitis publiziert) direkt die hier
beschriebenen Untersuchungen adressierte, und der andere (in Immunology Today publiziert)
diese Untersuchungen in einen größeren Zusammenhang stellt und den
derzeitigen
Stand unseres Wissens zur Pathophysiologie des Kontaktekzems zusammenfaßt. Diese
Untersuchungsreihe wurde inzwischen weitergeführt und vertieft. Zum Einen wurde
untersucht, ob tolerogene Haptene möglicherweise deswegen eine Immuntoleranz
induzieren, weil sie genau die oben beschriebene Fähigkeit zur Induktion einer
Entzündungsreaktion nicht besitzen. Hierzu machten wir uns zunutze, daß das
Hapten Dinitro-phenol (DNP) zum einen in einer immunogenen Form als
Dinitrofluorobenzol
(DNFB) und zum anderen in einer tolerogenen Form als Dinitrothiocyanobenzol (DNTB)
epikutan appliziert werden kann. Daher wurden Mäuse gegenüber DNFB
sensibilisiert, und eine Woche später wurde das Tolerogen DNTB zusammen mit
einem
irrelevanten Hapten epikutan zur Auslösung eines Kontaktekzems appliziert.
Während weder das irrelevante Hapten noch DNTB allein eine
Ohrschwellungsreaktion
auslösen konnten, führte die Kombination beider Substanzen zu einer starken
Ekzemreaktion, die von der durch das Allergen DNFB ausgelösten Reaktion nicht zu
unterscheiden war (Abb. 1). Diese Daten bestätigen die Relevanz unserer
ursprünglichen Beobachtung und deuten zudem darauf hin, daß eine Substanz
möglicherweise genau dann zum Allergen wird, wenn sie die Fähigkeit zur
Induktion einer Antigen-unabhängigen Immunaktivierung besitzt. Diese Befunde
werden
derzeit zur Publikation vorbereitet. Eine zweite Versuchsreihe hatte zum Ziel, die
Dissoziation
der spezifischen, allergenen und der unspezifischen, inflammatorischen Komponente von
Haptenen auch in vitro nachzuvollziehen, da hiermit ein sensitives Testsystem zur
Untersuchung
eines allergenen Potentials von neuen dermatologischen Substanzen etabliert werden
könnte. Der experimentelle Aufbau wurde so gewählt, daß Mäuse
mit
dem zu testenden Hapten sensibilisiert wurden und anschließend Zellsuspensionen aus
regionären Lymphknoten hergestellt wurden, die mit verschiedenen Konzentrationen
des
spezifischen Haptens in seiner wasserlöslichen Form in vitro stimuliert worden waren.
Zusammen mit diesem spezifischen Hapten wurde eine relativ hohe Dosis eines irrelevanten
Haptens, gegen das die Maus zuvor nicht sensibilisiert worden war, appliziert, in der
Annahme,
daß dieses irrelevante Hapten eine nicht haptenspezifische, generelle Aktivierung von
T Zellen verursacht und somit die Schwelle, ab derer sich eine Immunantwort gegen
die
zu testende Substanz zeigt, erniedrigt. Tatsächlich konnte gezeigt werden, daß
die
gleichzeitige Applikation eines zweiten, irrelevanten Haptens in vitro die spezifische
Immunantwort von Lymphknotenzellen aus Hapten-sensibilisierten Mäusen deutlich
verstärkt. Diese Untersuchungen legen die Schlußfolgerung nahe, daß die
oben beschriebene unspezifische proinflammatorische Eigenschaft von Haptenen zumindest
zum
Teil eine direkte Aktivierung von T Zellen bedingt und nicht allein über
indirekte
Mechanismen, z.B. die Freisetzung von Zytokinen aus epidermalen Keratinozyten, gesteuert
wird. Allerdings weisen diese in vitro-Experimente noch immer eine nicht unerhebliche
Variabilität auf, deren Ursache derzeit noch unbekannt ist. Daher haben diese Daten
noch
vorläufigen Charakter und müssen im weiteren Verlauf dieses Projektes
verifiziert
werden. Eine weitere Versuchsreihe hatte die nähere Charakterisierung des durch
Haptene
verursachten proinflammatorischen Reizes, der zur Auslösung einer Ekzemreaktion so
wichtig zu sein scheint, zum Ziel. Während unser ursprüngliches
Versuchsprotokoll
die gleichzeitige Verabreichung eines spezifischen Haptens in stark unterschwelliger
Konzentration, die allein nicht zur Auslösung eines Kontaktekzems ausreicht,
zusammen
mit einem irrelevanten zweiten Hapten in höherer Konzentration vorsah, wurden nun
anstelle des irrelevanten zweiten Haptens verschiedene definierte Substanzen appliziert, von
denen eine derartige Wirkung postuliert werden könnte. Es zeigte sich, daß
weder
die intrakutane Injektion von IL-1alpha, IL-1beta IL-12, TNFalpha, MIP-1alpha noch von
GM-CSF zusammen mit dem spezifischen Hapten in unterschwelliger Konzentration eine
gleichartige Wirkung wie Applikation eines zweiten Haptens hatte. Dies läßt
vermuten, daß der proinflammatorische Effekt von Haptenen nicht durch irgendeine
unspezifische Entzündung oder durch die Freisetzung gängiger
inflammatorischer
Zytokine bedingt ist, sondern daß eine recht spezifische Art der "Entzündung"
durch sie verursacht wird, die für die Auslösung des allergischen Kontaktekzems
essentiell zu sein scheint. Es muß allerdings offen bleiben, ob die Mediatoren in
optimaler
Dosierung injiziert wurden. Darüberhinaus kann nicht ausgeschlossen werden,
daß
eine bestimmte Kombination von Mediatoren notwendig ist, oder daß bislang nicht
identifizierte Faktoren diesen Effekt verursachen. Nachdem mehrere Faktoren in dieser
Hinsicht
untersucht worden waren, ohne daß so die für die Auslösung der Reaktion
relevante Substanz identifiziert werden konnte, wurde auf eine breit angelegte Analyse
verschiedener für diesen Effekt infrage kommender Faktoren verzichtet, da diese
Untersuchungen sonst zu sehr dem Zufallsprinzip unterworfen wären. Anstelle dessen
haben wir begonnen, einen alternativen Weg zur Charakterisierung des inflammatorischen
Signals einzuschlagen, der auch in der kommenden Förderperiode weiterverfolgt
werden
soll. Der zweite Arbeitsschwerpunkt dieses Projekts hatte die nähere Charakterisierung
der für die Auslösung der allergischen Kontaktdermatitis relevanten
Antigen-präsentierenden Zelle (APC) zum Inhalt. Eigene Voruntersuchungen hatten
ergeben, daß die epidermalen Langerhanszellen nicht wie zuvor allgemein
angenommen
für die Auslösung des allergischen Kontaktekzems notwendig sind, sondern
daß vielmehr ein Kontaktekzem in vollem Umfang (und sogar in verstärkter
Weise)
auch in Langerhanszell-depletierter Haut auslösbar ist. Zur Depletion der
Langerhanszellen wurden verschiedene Techniken verwendet, von denen die epikutane
Steroidapplikation ca. 2 Wochen vor Auslösung des Kontaktekzems die effektivste ist.
Wir haben daher zunächst untersucht, ob die für die Auslösung der
allergischen Kontaktdermatitis relevanten APC in der Epidermis und/oder in der Dermis
lokalisiert sind. Hierzu wurden epidermale bzw. dermale Zellpopulationen von
Langerhanszell-depletierter Haut und von Normalhaut jeweils mit und ohne vorherige
Auslösung eines Kontaktekzems gewonnen, durchflußzytometrisch hinsichtlich
ihrer Oberflächenmolekülexpression untersucht und anschließend auf ihre
Fähigkeit zur Antigen-Präsentation gegenüber sensibilisierten T-Zellen
untersucht. Hierdurch konnte gezeigt werden, daß die Anzahl von Makrophagen im
Gewebe schon kurz nach Auslösung des Kontaktekzems zunimmt. Weiterhin wurde
durch
Depletion von I-A+ bzw. CD11b (Mac-1)+ Zellen untersucht, ob I-A+ Zellen
(Langerhanszellen, dermale DC, Makrophagen), bzw. CD11b+ Zellen (weitgehend
Makrophagen) für die Antigen-Präsentation in diesem System verantwortlich
waren. Es zeigte sich jedoch, daß die verläßliche Isolierung der
verschiedenen
Zellpopulationen technisch schwierig ist, sodaß bislang keine komplett einheitlichen
Ergebnisse generiert werden konnten. Funktionelle Untersuchungen waren besonders
problematisch, da die hierzu erforderliche Zellzahl (besonders nach Auftrennung der Zellen
in
CD11b+ bzw. I-A+ Subpopulationen) oft nicht erreichbar war. Das zweite Problem
war
die ex-vivo Gewinnung von Hapten-reaktiven T Zellen aus Hapten-sensibilisierten
Mäusen, die oft nur geringe Antigen-spezifische Proliferation aufwiesen. Trotz dieser
Schwierigkeiten ist jedoch eindeutig, daß sowohl in Steroid-vorbehandelter Haut als
auch
in der Frühphase des Kontaktekzems Zellen in die Haut (sowohl Epidermis als auch
Dermis) einwandern, deren Oberflächenmolekülexpression und
Größe
denen von Makrophagen entspricht (Grabbe 1996 (abstr.)). Diese Untersuchungen wurden in
enger Kooperation mit der Arbeitsgruppe Sorg (Teilprojekt A8) durchgeführt, die uns
insbesondere mit den immunhistologischen Untersuchungen wesentlich geholfen hat. Sie
sollen
auch in Zukunft weitergeführt werden, wobei wir derzeit versuchen,
Hapten-spezifische
T Zell-Klone hierfür zu erhalten (Kontakte zu Prof. Weltzien, Freiburg und
Prof.
Kripke, Houston, wurden aufgenommen), die diese Untersuchungen vereinfachen sollten. In
einem parallelen Ansatz wurden immunhistologische Untersuchungen durchgeführt,
um
die durch topische oder systemische Kortisonapplikation bedingte Veränderung der
zellulären Zusammensetzung der Dermis näher zu analysieren. Diese
Untersuchungen ergaben ebenfalls eine Anreicherung mit Makrophagen als wesentlichen
Befund und sind daher mit den durchflußzytometrischen Untersuchungen gut vereinbar.
Daher wird unsere Arbeitshypothese, daß diese Zellen an der
Antigen-Präsentation
während der Auslösephase des Kontaktekzems beteiligt sind, unverändert
aufrechterhalten. Diese Daten stimmen gut mit denen anderer Arbeitsgruppen überein,
die
in Ekzemreaktionen und v.a. nach UVB-Bestrahlung ebenfalls die Einwanderung von
CD11b+
Makrophagen beschrieben haben (Baadsgaard O, Lisby S, Avnstorp C, Clemmensen O,
Lange-Vejlsgaard G. Scand J Immunol 32:217-224, 1990; Hammerberg C, Duraiswamy N,
Cooper KD. J Invest Dermatol 107:755-763, 1996), oder die ebenfalls die
Antigenpräsentation durch unterschiedliche APC-Populationen untersuchten (Bacci S,
Alard P, Dai R, Nakamura T, Streilein JW. Eur J Immunol 27:442-448, 1997). Weiterhin
haben
wir versucht, die funktionelle Relevanz dieser in die Haut nach Antigenapplikation
einwandernden Makrophagen zu untersuchen. Dazu wurden Mäuse mit einer
Spontanmutation im M-CSF Gen (sog. op/op Mutation), die nur noch sehr wenige
Gewebsmakrophagen haben, hinsichtlich ihrer Regulation der Kontaktekzem-Reaktion
untersucht. Hier zeigte sich jedoch, daß die Tiere in unserem Tierstall nur unzureichend
gezüchtet werden konnten (Spontanletalität nach ca. 3-4 Wochen), und auch
durch
den Tierzuchtbetrieb selbst nicht in hinreichender Anzahl zur Verfügung gestellt
werden
konnten, um derartige Experimente durchzuführen. Zum anderen wurde versucht,
durch
Injektion von für Makrophagen selektiv toxischen Liposomen (beladen mit Cl2-MBP)
gezielt Makrophagen in vivo aus der Haut zu depletieren. Die Injektion dieser Liposomen
zeigte
auch die erwarteten Resultate, nämlich daß nach Makrophagen-Depletion die
Auslösung des Kontaktekzems deutlich beeinträchtigt ist (Grabbe 1996
(Abstr.)).
Parallel durchgeführte immunhistologische Untersuchungen ergaben jedoch, daß
durch die Injektion dieser Liposomen gleichzeitig eine starke subkutane
Entzündungsreaktion ausgelöst wird, die die Interpretation dieser Ergebnisse
sehr
stark erschweren. Es ließ sich keine Toxindosis finden, die zwar Makrophagen
eliminiert,
aber keine wesentliche Entzündung verursacht, sodaß diese Strategie nicht weiter
verfolgt wurde. Daraufhin haben wir uns entschlossen, uns dieser Fragestellung auf eine
andere
Weise zu nähern, die in der ursprünglichen Antragstellung nicht vorgesehen
war.
Um die für die Auslösung des allergischen Kontaktekzems relevanten APC zu
identifizieren und um herauszufinden, ob nach Allergenapplikation in die Haut einwandernde
nicht-residente APC hierfür verantwortlich sind, haben wir uns eines Mausmodells
bedient, bei dem durch Gen-Targeting das CD18 Molekül inaktiviert wurde. Das CD18
Molekül ist für die Bildung der beta2 Integrine LFA-1 (CD11a/CD18), Mac-1
(CD11b/CD18) und p150/95 (CD11c/CD18) erforderlich. Über diese Moleküle
werden eine Reihe von Funktionen gesteuert, die sowohl für die
Antigen-Präsentation und Funktion von Dendritischen Zellen (DC) und Makrophagen
als
auch insbesondere für die Transmigration von Leukozyten aus dem Blut in
entzündliche Gewebe verantwortlich sind. In einem ersten Schritt wurden diese von
Frau
Prof. Scharffetter-Kochanek, Universitäts-Hautklinik Köln, hergestellten CD18
knockout Mäuse durch unsere Arbeitsgruppe immunologisch untersucht. Es zeigte
sich,
daß diese Tiere einen sehr interessanten Phänotyp haben und vielerlei
Abnormitäten bei fast allen Leukozytenpopulationen aufweisen
(Scharffetter-Kochanek
1998). Daher hat sich die Charakterisierung dieses Mausstammes zu einem recht
umfangreichen
Projekt ausgeweitet, welches zahlreiche für dieses Projekt relevante Ergebnisse
erbracht
hat. Hierbei ergab eine Charakterisierung der T Zell-Funktion dieser Tiere eine
fehlende
homotypische T Zell-Aggregation, eine deutlich verminderte Stimulierbarkeit
über
TcR-vermittelte Signale (anti-CD3, gemischte Lymphozyten-Reaktion), jedoch eine
verstärkte Stimulierbarkeit durch Mitogene und Lektine (PMA, ConA, Ionomycin).
Weiterhin zeigte sich, daß CD18-defiziente Mäuse annähernd keine CD8+
T Zellen in Blut und Lymphknoten haben, zumindest ab einem gewissen Alter der
Tiere.
Hieraus ergibt sich, daß CD18 (1) für die homotypische Aggregation von
T Zellen unabdingbar ist, (2) zur adäquaten TcR-vermittelten
T Zellaktivierung beiträgt, und (3) an der Regulation von
T Zell-Populationen, insbesondere der CD8+ T Zellen, beteiligt ist
(Grabbe
1998 (Abstr)). In einem nächsten Schritt wurde die Bedeutung der beta2-Integrine
für die Antigen-Präsentation untersucht, da ja jedes der von CD18 und
CD11a/b/c
gebildeten Heterodimere in hohem Maße auf APC exprimiert wird. Zunächst
konnte
nachgewiesen werden, daß die Abwesenheit von CD18 zu vollständig fehlender
Expression von CD11a und CD11b führt, daß jedoch CD11c auch
unabhängig von seinem heterodimeren Bindungspartner CD18 auf der
Oberfläche
von DC exprimiert wird (Roters 1998). Auf funktioneller Ebene zeigte sich, daß DC
aus
CD18-defizienten Mäusen keine dramatisch eingeschränkte Funktion haben,
jedoch
bei limitierten Antigenmengen deutlich geringere immunstimulatorische Kapazität als
DC
von Wildtyp-Mäusen aufweisen. Auch die homotypische Aggregation von DC und die
Aggregation von DC mit T Zellen ist durch die Abwesenheit der beta2-Integrine nur
gering beeinträchtigt. Somit sind beta2-Integrine und insbesondere die für DC
und
Makrophagen charakteristischen Moleküle CD11b und CD11c nicht von wesentlicher
Bedeutung für die Antigen-Präsentation, sie erhöhen jedoch die
Wahrscheinlichkeit einer produktiven Stimulation von T Zellen bei
Antigenpräsentation. Schließlich wurde noch untersucht, ob beta2-Integrine
für die Einwanderung von epidermalen Langerhanszellen in die Haut oder für
deren
Auswanderung nach Applikation eines Entzündungsreizes (z.B. Kontaktallergen)
essentiell sind. Sowohl die Anzahl von Langerhanszellen in der Haut unter
Normalbedingungen
als auch ihre Auswanderung nach Applikation eines Kontaktallergens als auch die
Repopulation
der Haut mit neuen Langerhanszellen nach vorheriger Allergen-bedingter Auswanderung war
jedoch normal. Hieraus ergibt sich, daß die akute Transmigration von Leukozyten in
entzündliche Gewebe offensichtlich anderen Mechanismen unterliegt als die
chronische
Repopulation peripherer Gewebe mit residenten Zellen leukozytären Ursprungs.
Nachdem
nun also sowohl die T Zell-Funktion als auch die Funktion von APC sowie andere
immunologische Parameter in diesen CD18-defizienten Mäusen definiert worden
waren,
haben wir untersucht, inwieweit die Ausbildung eines allergischen Kontaktekzems in diesen
Tieren gestört ist. Es stellte sich heraus, daß Kontaktekzemreaktionen in
CD18-defizienten Mäusen nicht auslösbar sind (>95% Reduktion
gegenüber
der Wildtyp-Kontrolle). In gleichartiger Weise ist auch die Immunreaktion vom
verzögerten Typ ("delayed-type hypersensitivity", DTH) nach subkutaner Injektion von
haptengekoppelten APC total blockiert. Dies wurde auch anhand von immunhistologischen
Untersuchungen von Hautschnitten bestätigt, die ein fast vollständiges Fehlen
von
inflammatorischen Zellen am Ort der Allergenapplikation ergaben. Interessanterweise war
jedoch die Ohrschwellungsreaktion nach Applikation eines Irritans nicht vermindert
(wenngleich
auch histologisch ein vermindertes zelluläres Infiltrat nachweisbar war), was zeigt,
daß interstitielles Ödem und zelluläres Infiltrat bei der Ekzemreaktion eine
voneinander getrennte Pathophysiologie haben und keinesfalls das Ödem die Folge des
zellulären Infiltrats ist. Nachdem gezeigt werden konnte, daß CD18-defiziente
Mäuse eine so profunde Reduktion des allergischen Kontaktekzems aufweisen, wurde
als
nächstes untersucht, ob CD18-defiziente Mäuse sensibilisierbar sind, oder ob die
Blockade im Bereich der Auslösephase liegt. Daher wurden regionäre
Lymphknoten von CD18-defizienten Mäusen nach epikutaner Sensibilisierung
gewonnen
und hinsichtlich einer proliferativen Antwort auf in vitro appliziertes Hapten und APC
untersucht, wobei eine haptenspezifische Proliferation auch in CD18-defizienten Tieren
nachweisbar war. Somit sind diese Tiere grundsätzlich sensibilisierbar, sodaß die
Blockade der Kontaktekzemreaktion auf der Ebene der Auslösephase liegen
muß.
Dies ist auch plausibel, da beta2-Integrine ja von entscheidender Bedeutung für die
transendotheliale Migration von Leukozyten in inflammatorische Gewebe sind. Um dies
näher zu untersuchen, wurden Transfer-Experimente durchgeführt, in denen
T Zellen aus regionären Lymphknoten von CD18-defizienten Mäusen
präpariert wurden und unmittelbar nach Applikation eines Kontaktallergens direkt
intrakutan in hapten-sensibilisierte, syngene CD18-defiziente Mäuse injiziert wurden.
Auf
diese Weise wurde die Notwendigkeit zur Extravasation der T Zellen umgangen. Es
zeigte sich, daß hierdurch die Ekzemreaktion vollständig wiederhergestellt
werden
konnte, was darauf hindeutet, daß die Ursache der fehlenden Kontaktekzemreaktion in
diesen Tieren tatsächlich in der Unfähigkeit der T Zellen zur
Auswanderung
aus dem Blut in hapten-applizierte Haut liegt. Somit konnte geklärt werden, daß
beta2-Integrine absolut essentiell für die Auslösephase des allergischen
Kontaktekzems sind. Diese Daten wurden z.T. bereits veröffentlicht, der
Großteil
steht jedoch noch zur Veröffentlichung an. Dieses Mausmodell, welches nun recht gut
immunologisch untersucht ist, kann in Zukunft zur Klärung der Frage, welche APC
für die Auslösung des Kontaktekzems relevant sind, verwendet werden. In
Erweiterung der ursprünglichen Ziele des Vorantrags wurden noch zwei
zusätzliche
Versuchsreihen durchgeführt, anhand derer die Mechanismen der
Antigen-Präsentation im Rahmen der Auslösephase des allergischen
Kontaktekzems untersucht wurden. Zunächst wurde untersucht, ob zur
Auslösung
des Kontaktekzems MHC Klasse I oder MHC Klasse II Moleküle notwendig sind.
Hierzu
wurden MHC Klasse I-defiziente bzw. MHC Klasse II-defiziente Mäuse hinsichtlich
ihrer
Fähigkeit zur Generierung eines Kontaktekzems untersucht. Im Gegensatz zu
kürzlich veröffentlichten Daten (Bouloc A, Cavani A, Katz SI. J Invest
Dermatol
111:44-49, 1998), die zeitgleich mit der Durchführung dieser eigenen Untersuchungen
publiziert wurden, konnten wir keine wesentliche Einschränkung des Kontaktekzems
in
MHC Klasse I-defizienten oder in MHC Klasse II-defizienten Mäusen finden. Der
Unterschied zu den publizierten Daten mag hier in der Verwendung eines anderen Haptens
sowie eines anderen Mausstammes liegen, ist aber ansonsten unklar. Unsere Untersuchungen
zeigen jedoch, daß zumindest das von uns verwendete Hapten Oxazolon (OXA) weder
ausschließlich über MHC Klasse I noch ausschließlich über MHC
Klasse II erkannt und präsentiert wird. Interessanterweise konnte ein Kontaktekzem in
MHC Klasse I-defizienten Mäusen sogar noch immer in vollem Umfang
ausgelöst
werden, wenn auch in der Haut befindliche MHC Klasse II+ Zellen durch topische
Steroidapplikation zuvor depletiert worden waren. Diese Ergebnisse sind wiederum vereinbar
mit dem Konzept, daß nicht ortsansässige, sondern kurz nach
Allergenapplikation
in die Haut einwandernde APC für die Präsentation des Allergens und die
nachfolgende Auslösung des Kontaktekzems verantwortlich sind. Während wir
jedoch bei der Erstantragstellung gemäß dem damaligen Wissensstand noch
davon
ausgegangen waren, daß die CHS eine obligat MHC II abhängige Reaktion ist,
zeigten diese Untersuchungen, daß dies nicht der Fall ist. Daher sind unter
Fortführung unserer bisherigen Arbeitshypothese weitere Experimente zur
Aufklärung der Frage geplant, ob nicht ortsständige, in der Frühphase der
Ekzemreaktion in den Ort der Allergenapplikation einwandernde APC für die
Auslösung der Reaktion von Bedeutung sind, oder ob Antigenpräsentation durch
ortsständige, in der Haut lokalisierte APC hierfür erforderlich ist. In
Ergänzung zu den hier dargestellten Experimenten wurden noch weitere
Versuchsreihen
durchgeführt, die ebenfalls die Regulation und Pathophysiologie des allergischen
Kontaktekzems zum Inhalt hatten. Diese Untersuchungen wurden im wesentlichen von nicht
durch dieses Projekt geförderten Wissenschaftlern unserer Arbeitsgruppe
durchgeführt, sind jedoch in diesem Rahmen von Interesse. Zum einen wurde
untersucht,
ob das Thy-1 (CD90) Molekül für kutane Immunantworten von Bedeutung ist.
Thy-1 wird neben neuronalen Zellen selektiv von T Zellen und auch in geringen
Mengen
von Keratinozyten exprimiert, sodaß eine Untersuchung der Bedeutung dieses
Moleküls für das Kontaktekzem und andere Immunreaktionen vom
verzögerten Typ naheliegt. Hierzu wurden Thy-1-defiziente Mausstämme
verwendet und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Produktion von
T Zell-vermittelten
Immunantworten untersucht (Beissert 1998). Es zeigte sich ein im wesentlichen normaler
Immunstatus dieser Tiere, wobei allerdings Kontaktekzemreaktionen und insbesondere die
aktivierungsabhängige Tyrosinphosphorylierung in T Zellen durch die
Abwesenheit von Thy-1 inhibiert ist. Somit konnte nachgewiesen werden, daß Thy-1
für die antigenspezifische Aktivierung von T Zellen in vitro und in vivo von
Bedeutung ist, wobei allerdings weder die Funktion antigenpräsentierender Zellen noch
die der T Zellen durch die Abwesenheit dieses Oberflächenmoleküls
fundamental gestört zu sein scheint. Eine andere Untersuchungsreihe unserer
Arbeitsgruppe hatte zum Ziel, die Mechanismen der UV-induzierten Suppression des
Kontaktekzems näher zu definieren. In diesem Zusammenhang konnte kürzlich
gezeigt werden, daß zum einen die für die UV-bedingte Unterdrückung
des
Kontaktekzems verantwortlichen negativ regulatorischen T Zellen im wesentlichen
CD8+
sind, und daß insbesondere die Funktion dieser negativ regulatorischen T Zellen
über eine Beeinträchtigung der Antigen-Präsentation und in
Fas(CD95)/FasL(CD95L) gesteuerter Weise zu erfolgen scheint. Es konnte hier durch
Verwendung von Fas- bzw. FasL-defizienten Mäusen gezeigt werden, daß die
UV-induzierte Suppression des Kontaktekzems nicht Fas/FasL abhängig ist,
wohingegen
die UV-bedingte Induktion einer langlebigen Immuntoleranz absolut
Fas/FasL-abhängig
ist (Schwarz 1998). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die für die
Suppression
des Kontaktekzems verantwortlichen negativ regulatorischen T Zellen die Apoptose
von
Hapten-tragenden APC verursachen und demzufolge die UV-vermittelte Toleranzinduktion
anscheinend dadurch entsteht, daß in der Anwesenheit dieser negativ regulatorischen
T Zellen eine effiziente Präsentation des Haptens verhindert wird. Im Rahmen
einer
klinischen Untersuchung ergab sich zusätzlich die Möglichkeit, den
Einfluß
von Steroiden auf die Auslösung des allergischen Kontaktekzems im Humansystem zu
untersuchen. Ziel dieser Studie war es, die Bedeutung des TNF-Inhibitors Pentoxifyllin als
potentielles immuntherapeutisches Agens zur Behandlung des allergischen Kontaktekzems
beim
Menschen zu untersuchen, da wir zeigen konnten, daß die systemische Gabe von
Pentoxifyllin die Auslösephase des allergischen Kontaktekzems sowohl im
Maussystem
als auch beim Menschen unterdrückt (Schwarz A, Krone C, Trautinger F, Aragane Y,
Neuner P, Luger TA, Schwarz T. J Invest Dermatol 101:549-552, 1993). Zusätzlich
sollte
diese Studie Aufschluß darüber geben, ob eine Depletion der epidermalen
Langerhanszellen die Auslösbarkeit eines allergischen Kontaktekzems beeinflußt
(Grabbe S, Steinbrink K, Steinert M, Luger TA, Schwarz T. J Immunol 155:4207-4217,
1995).
Es zeigte sich, daß Pentoxifyllin ohne Effekt auf das Nickel-bedingte Kontaktekzem
beim
Menschen ist, und daß eine vorherige Steroidapplikation die Auslösung eines
Kontaktekzems unterdrückt (Brehler 1998). Somit ergeben sich Unterschiede zwischen
der Ekzemreaktion des Menschen und der Maus, wobei allerdings noch geklärt werden
muß, ob die Steroidbehandlung im Humansystem zu einer adäquaten Depletion
epidermaler Langerhanszellen geführt hat und ob noch eine immunsuppressive
Restaktivität der Steroide zum Zeitpunkt der Allergenapplikation vorhanden war.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß unsere im Vorantrag formulierten
Arbeitshypothesen weiterhin Bestand haben, und daß deren Bearbeitung zu wichtigen
Erkenntnissen geführt hat, die in einer Reihe von Publikationen resultierten bzw. deren
Publikation in Vorbereitung ist. Darüberhinaus wurden vielversprechende
präliminäre Daten erhoben, die in den im folgenden beschriebenen Zielen der
kommenden Antragsperiode weiter untersucht werden sollen. Von zentraler Bedeutung
für die Pathophysiologie der Auslösephase des Kontaktekzems ist die Frage, ob
die
Rekrutierung von APC aus der Zirkulation in die Haut für die Auslöösung
des allergischen Kontaktekzems notwendig ist, oder ob in der Haut befindliche APC dazu
ausreichen. Zur Aufklärung dieser Frage wird das Modell der CD18-defizienten
Mäuse einen wesentlichen Beitrag leisten. Darüberhinaus sollen gerade in
Anbetracht der neuen Erkenntnisse, daß, im Gegensatz zur DTH-Reaktion, CD4+
T Zellen bei der CHS nicht von essentieller Bedeutung sind, die Pathophysiologie der
Auslösephase von CHS und DTH verglichen werden. Da, wie oben dargestellt, die
intraläsionale Injektion von Zytokinen eine nähere Charakterisierung der Natur
des
für die Auslösung des Kontaktekzems erforderlichen Entzündungsreizes
nicht erlaubt hat, soll diese Frage nun durch Identifizierung der Zielzelle, an der Haptene
diese
unspezifische Wirkung ausüben, weiter bearbeitet werden.
Drittmittelgeber:
Beteiligte Wissenschaftler:
Veröffentlichungen: |
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Hans-Joachim Peter