Funktion von GTP-bindenden Proteinen im intrazellulären Transport und bei der Organisation des Zytoskeletts

Die GTP-bindenden Proteine der ras-Superfamilie regulieren eine Vielzahl essentieller Vorgänge in eukaryotischen Zellen. Man kennt heute die fünf Unterfamilien ras, rab, rho, ran und Art. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen steht neben dem rab6 und dem rab1 Protein, zwei Mitgliedern der rab Familie, auch das rho Protein. Rab1 und rab6 regulieren verschiedene Schritte des exozytotischen Transportprozesses. Dabei durchlaufen sie einen Zyklus aus einer zytosolischen und einer membrangebundenen Form. Bei unseren Untersuchungen zu den rab-Proteinen stehen zwei Fragestellungen im Vordergrund: 1. Wie erfolgt die posttranslationale Modifikation der rab Proteine? 2. Welche molekularen Mechanismen und Proteine sind bei der spezifischen Membranlokalisation der rab Proteine beteiligt? Unsere bisherigen Ergebnisse zeigen, daß die Nukleotid-induzierte Konformation der rab Proteine für beide Vorgänge ein Steuerungssignal darstellt. Nur die GDP-Form der rab Proteine wird effizient mit Geranylgeranylgruppen modifiziert. Diese Isoprenylierung ist notwendig, um eine Anheftung an intrazelluläre Membranen zu ermöglichen. Für die Lokalisation der rab Proteine auf spezifischen intrazellulären Membranen ist ein noch nicht näher charakterisierter Mechanismus verantwortlich. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch, daß für diese Zielsteuerung der Austausch von GDP gegen GTP notwendig ist. Ein wichtiger Faktor für die Membrananbindung und die Translokation von rab Proteinen zurück ins Zytosol stellen die rabGDI (guanosine nucleotide inhibitor) Proteine dar. Wir konnten zeigen, daß die molekulare Wechselwirkung zwischen dem rab6 Protein und dem rabGDI-Polypeptid ebenfalls von der Konformation, aber nicht von der posttranslationalen Isoprenylierung abhängig ist. In Säugerzellen führt eine Überexpression des rabGDI-Proteins zu starken morphologischen Veränderungen des Golgi Apparates. Diese werden wahrscheinlich dadurch ausgelöst, daß erhöhte Konzentrationen des GDI-Proteins die Fusion von intrazellulären Transportvesikeln hemmen.

Rho-Proteine steuern die Ausbildung des Aktinzytoskeletts in eukaryotischen Zellen. Während der neoplastischen Transformation von Zellen durch das v-src-kodierte Protein, pp60^v-src, kommt es zum Abbau des Aktinzytoskeletts und damit auch zur Veränderung der Zellform. Diese Prozesse werden durch erhöhte Phosphorylierung einer ganzen Gruppe von Zielproteinen ausgelöst. Wir konnten zeigen, daß eine aktivierte Form des rho Proteins die, durch pp60^v-scr induzierten Veränderungen (Auflösen von Stressfasern und Adhäsionsplaques) revertieren kann. Transformierte Zellinien, welche aktivierte Formen des rho Proteins exprimieren, zeigen eine veränderte, Fibroblasten-ähnliche Morphologie, während andere Transformations-spezifischen Parameter unverändert bleiben.

Mit Hilfe des "yeast two-hybrid"-Systems wurde nach spezifischen Interaktionspartnern der rab1b-GTPase gesucht. Hierzu wurden verschiedene rab1b-Mutanten eingesetzt, die die inaktive GDP-gebundene Konformation, den Nukleotid-freien Zustand, oder die daueraktive GTP-gebundene Konformation des rab1b-Proteins simulieren. Der Einsatz der inaktiven bzw. Nukleotid-freien rab1b-Mutante führte zur Isolierung von Mss4 und einem 35 Aminosäuren umfassenden Peptidfragment (35-AS-Peptid), für die jeweils eine Nukleotid-abhängige und damit konformationsspezifische Interaktion mit rab1b aufgezeigt werden konnte. In einem weiteren Ansatz wurde die Spezifität des rab1b-"targeting"-Prozesses mit verschiedenen rab1b-Mutanten in Zellfraktionierungs- und Immunfluoreszenzstudien analysiert. Es zeigte sich, daß nur das rab1b wt-Protein normal in der Zelle lokalisiert ist. Alle rab1b-Mutanten hingegen sind diffus in der Zelle verteilt. Aus diesen Beobachtungen ist ein Mechanismus der rab-Membranassoziation abgeleitet worden, der nahe legt, daß neben hypervariablen Regionen, Effektordomäne und posttranslationaler Prenylierung vor allem die Fähigkeit zum Nukleotidaustausch wesentlich für das korrekte "targeting" einzelner rab-GTPasen ist. Zukünftige Untersuchungen sollen vor allem der weiteren Auffindung neuer rab1b-spezifischer Effektoren dienen, die hauptsächlich mit der aktiven Konformation bzw. der rab1bQ67R-Mutante interagieren.

Drittmittelgeber:

Deutsche Forschungsgemeinschaft, Sonderforschungsbereich 310 Intra- und interzelluläre Erkennungssysteme", Teilprojekt A9

Beteiligte Wissenschaftler:

Prof. Dr. A. Barnekow (Leiterin), Dr. T. Mayer (Leiter), Dr. A. Schiedel, Dipl.-Biol. M. Altenbäumer, Dipl.-Biol. G. Bode, Dipl.-Biol. O. Gartenschläger, Dipl.-Biol. T. Weide, Dipl.-Chem. B.-O. Jackisch (Institut für Physiologische Chemie und Pathobiochemie, WWU Münster), Dipl.-Biol. D. Zeuschner, Dipl.-Biol. M. Koltscher (Institut für Medizinische Biochemie, ZMBE Münster), PD Dr. P. Wagner, Prof. Dr. M. Montenarh (Institut für Medizinische Biochemie, Universität des Saarlandes), Prof. Dr. Z. Elazar (Weizmann Institute, Rehovot, Israel), Prof. Dr. I.G. Macara (Center of Cell Signalling of Virginia Charlottesville, Virginia, USA), Prof. Dr. S.R. Pfeffer (Dept. Cell Biology, Stanford University, California, USA), Prof. Dr. M. Wiedmann (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, USA), Dr. K. van Leyen (Memoria Sloan Kettering Cancer Center, New York, USA)

Veröffentlichungen:

Weide, T., T. Mayer, A. Barnekow: A Yeast two-hybrid screen to identify proteins interacting with rab1. Europ. J. Cell Biol. 72, 42 (1997).

Mayer, T.: Rab proteins: Molecular switches at multiple steps of vesicular transport. Chem. Tracts 11, 459-479 (1998).

Meyer, T., T. Mayer, A. Tiedtke: Maturation of phagosomes is accompanied by specific pattern of small GTPases. Electrophoresis 19, 2528-2535 (1998).