Charakterisierung der vorzeitigen und intrazellulären Aktivierung von Proteasen bei der experimentellen Pankreatitis

Es ist bekannt, daß eine supramaximale Stimulation des Pankreas mit dem CCK-Analogon Caerulein sowohl in-vivo als auch in-vitro zur vorzeitigen, intra-pankreatischen Trypsinogen-Aktivierung führt. Ob dies eine kaskadenartige Aktivierung weiterer Proteasen nach sich zieht, ist dagegen nicht bekannt. Wir haben die zeitabhängige Aktivierung von Trypsinogen und Proelastase in lebenden, isolierten Pankreasazini nach supramaximaler Stimulation untersucht. Mit hochgereinigten Enzymen (Boehringer) konnten wir die vollständige Spezifität der fluorogenen Substrate (CBZ-Ile-Pro-Arg)2-Rhodamin-110 für Trypsin und (CBZ-Ala4)2-Rhodamin-110 für Elastase belegen. Isolierte Azini aus Rattenpankreas wurden mittels Kollagenaseverdau gewonnen und in Mikrotiter-platten mit Substrat (10mM) inkubiert. Konzentrationen von Caerulein (10^-8 M, nicht aber niedrigere Konzentrationen, führten zu einer zeit- und dosisabhängigen Zunahme der durch Substratspaltung freigesetzten Rhodamin-110-Fluoreszenz (Ex485/Em 530nm; Cytofluor 2350, Millipore) und somit zur intrazellulären Aktivierung von Trypsinogen und Proelastase. Zur Untersuchung der zeitlichen Abfolge der jeweiligen Aktivierung wurden Azini nur 1 min supramaximal stimuliert (10^-8 M Caerulein), gewaschen, anschließend mit Substrat inkubiert und in 5-minütigen Abständen die Fluoreszenzfreisetzung gemessen. Während es bereits nach 20 min zu einer Trypsi-nogen-Aktivierung kam, wurde Proelastase erst nach 50 min aktiviert. In inaktiven Pankreashomogenaten führte der Zusatz einer geringen Menge aktiven Trypsins (30pM) sowohl zu einer zeitabhängigen Trypsinogen-, als auch zu einer Proela-stasen-Aktivierung. Die Anwesenheit von Leupeptin (Ac-Leu-Leu-argininal x 12 H2SO4), einem Proteaseninhibitor, der, wie wir zeigen konnten, in Konzentrationen von 100mM Trypsin vollständig hemmt aber keinerlei Hemmung der Elastase bewirkt, kam es weder zu einer Trypsinogen- noch zu einer Proelastasen-Aktivierung. In lebenden Pankreasazini führt die supramaximale Stimulation mit Caerulein nicht nur zu einer intrazellulären Trypsinogen-Aktivierung, sondern auch zu einer kaskadenartigen, kausal und zeitlich von der Trypsinogen-Aktivierung abhängigen Aktivierung weiterer Proteasen - wie zum Beispiel der Elastase.

Beteiligte Wissenschaftler:

Prof. Dr. med. M.M. Lerch, Dr. rer. nat. J. Schneckenburger, Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Domschke

Veröffentlichungen:

Lerch, M.M., B. Krüger, W. Tessenow, W. Domschke: Die Rollte der Proteasenaktivierung in der Pathophysiologie der akuten Pankreatitis. Langenbecks Arch. Chir. 1998; 115 (Suppl II): 421-426

Hofbauer, B., A.K. Saluja, M.M. Lerch, L. Bhagat, M. Bhatia, H.S. Lee, J.L. Frossard, G. Adler, M.L. Steer: Intra-acinar cell activation of trypsinogen during caerulein-induced pankreatitis in rats. Am. J. Phys. 1998;275:G352-G362

Krüger, B., M.M. Lerch, W. Tessenow: Direct detection of premature proteases activation in living pancreatic acinar cells. Lab. Invest. 1998;78:763-764

Grady, T., M. Mahïmoud, T. Otani, S. Rhee, M.M. Lerch, F.S. Gorelick: Zymogen proteolysis within the pancreatic acinar cell is associated with cellular injury. Am. J. Physiol. 1998;275:G1010-G1017