Gruppe Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen
IFN-? induziert Myosin vermittelte Endozytose von
Einleitung:
Die Darmschleimhaut dient als dynamische Barriere. Unter physiologischen Bedingungen gewährleistet sie eine regulierte Resorption von
Nährstoffen und Wasser. Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) ist die Barrierefunktion, welche durch tight junctions (TJ) reguliert wird,
gestört. Mittels in vitro Versuchen konnten wir zeigen, dass das in der CED-Mukosa erhöhte proinflammatorische Zytokin Interferon (IFN)- zu einer
Internalisierung der TJ-Proteine Occludin, Junction Adhesion Molecule (JAM)-A, Claudin-1 und -4 mit reversiblem Verlust der Barrierefunktion führt. Dabei waren
endozytotische Mechanismen involviert. Es gibt Hinweise, dass das Aktin-Zytoskelett, sowohl in der Regulation der Barrierefunktion, als auch in Endozytose Mechanismen
involviert ist.
Zielsetzung:
Ziel dieser Studie
war es die Rolle des Aktin-Zytoskeletts, sowie des Motor-Proteins, Myosin, während der IFN- induzierten TJ Endozytose zu untersuchen.
Material und Methoden:
Nach Inkubation konfluenter T84-Epithelzellen mit 100U/ml IFN- wurde durch pharmakologische Inhibitoren (Latrunkulin B und Jasplakinolide) der Aktinpoly- und
Depolymerisation der Einfluss des Aktin-Zytoskelletts auf die Endozytose von TJ Proteinen untersucht. Im Verlauf der TJ Internalisierung wurden Aktin-Polymerisation
regulierende Proteine (ARP2/3, VARP und Cortactin) mittels Immunofloureszenz/konfokaler Mikroskopie beobachtet. Die Funktion von Nonmuscle Myosin (NMM) IIA wurde
durch einen selektiven pharmakologischen Inhibitor, Blebbistatin, untersucht. Die Lokalisation von NMM IIA, sowie Myosin light Chain (MLC) und dessen mono- (p-MLC)
und diphosphorilierter (pp-MLC) Form wurde ebenfalls mittels Immunofloureszenz/konfokaler Mikroskopie bestimmt. Western Blots für MLC, p-MLC und pp-MLC
wurden zur Bestimmung des Aktivierungszustande des NMM IIA durchgeführt. Zur Quantifizierung der jeweiligen Protein-Expression wurde eine Densometrie
durchgeführt und gegenüber den Kontrollen verglichen. Die statistische Testung erfolgte mittels Student's t-Test. Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SEM
angegeben mit einem Signifikanzniveau von p< 0.05.
Bisherige Ergebnisse:
Internalisiertes Occludin, JAM-A und Claudin-1 wurden durch IFN- Inkubation in großen, Aktin ummantelten Vacuolen beobachtet. Diese Vacuolen beinhalteten
ausschließlich Marker der apikalen Plasmamembran und entsprechen dem vacuolar apical compartment (VAC). Sowohl Inhibierung der Aktinpoly- als auch
Depolymerisation konnte die Endozytose der TJ Proteine nicht blockieren. Eine signifikante Co-Lokalisation der Aktin regulierender Proteine und VACs wurde nicht
beobachtet. Vielmehr konnte die Entstehung von VACs und die Endozytose der TJ Proteine durch Blebbistatin inhibiert werden. Sowohl die Expression von P-MLC
(138,8± 3,2 %), als auch PP-MLC (142,4 ± 2,7%), war bei konstanter MLC-Expression durch IFN- Inkubation signifikant erhöht. P-MLC, die aktivierte
Form von NMM IIA, co-lokalisierte nach IFN- Inkubation mit VACs.
Schlussfolgerung:
Unsere Ergebnisse zeigen, das IFN- die Endozytose von TJ Proteinen Occludin, JAM-A und Claudin-1 in VACs induziert. Das Aktin-Zytoskelett ist nicht die treibende
Kraft für die TJ Endozytose und VAC-Formation. Vielmehr ist dieser Prozess durch das Motor-Protein, Myosin vermittelt. Diese Mechanismen könnten bedeutsam
sein für pathophysiologische Vorgänge im Rahmen der veränderten Barrierefunktion bei CED und Ansätze für eine therapeutische Stabilisation
der Barrierefunktion geben.
Beteiligte Wissenschaftler:
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