Teilprojekt B6 (Lügering/Kucharzik/Stoll/Domschke): Zellulärer Dialog von humanen intestinalen Epithelzellen und mikrovaskulären Endothelzellen in vitro: Beziehung zur Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen

Projektleiter:	Priv.-Doz. Dr. med. Norbert Lügering, Dr. med. Torsten Kucharzik, Prof. Dr. med. Reinhard Stoll, Prof. Dr. med. Dr. h.c. Wolfram Domschke
Dienstanschrift:	Medizinische Univ.-Klinik B Albert-Schweitzer-Str. 33, 48129 Münster
Telefon:	(0251) 83-47661
Telefax:	(0251) 83-47570
E-Mail:	Lugering@uni-muenster.de, Kucharzik@uni-muenster.de, Stoll@uni-muenster.de, Domschke@uni-muenster.de

1.	(ab Juli 1998): Kenntnisstand bei der letzten Antragsstellung Die Ätiologie der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, für die in vielen Fällen keine dauerhaft befriedigende Therapie zur Verfügung steht, ist unklar. Die Initiierung wie auch die Chronifizierung der intestinalen Entzündungsreaktion lassen sich weitgehend aus Ungleichgewichten zwischen pro- und kontraentzündlichen Mediatoren und Chemokinen erklären. Die normale intestinale Mukosa hat die Fähigkeit, größere Läsionen vollständig zu erneuern. Bei CED ist die anhaltende entzündliche Gewebszerstörung ein charakteristisches Phänomen. Das Epithel des humanen Gastrointestinaltraktes ist ein immunologisches Kompartiment, welches durch die Basalmembran von der Lamina propria getrennt wird. Entscheidend für die mechanische Integrität der Mukosa ist eine kontinuierliche, intakte Epithelzellschicht, die die ungeregelte Invasion einer Vielzahl von bakteriellen und anderen luminalen Antigenen verhindert. Das intestinale Epithel ist außerdem in der Lage, durch Präsentation von Antigenen in den Verlauf des intestinalen Entzündungsgeschehens entscheidend einzugreifen. So exprimieren Epithelzellen gesunder Kontrollpersonen MHC-Klasse-I-Moleküle und induzieren suppressiv wirkende zytotoxische T-Zellen, während bei CED-Patienten auch MHC-Klasse-II-Moleküle am Epithel nachweisbar sind. Die Verwendung von MHC-Klasse-II-Molekülen zur Antigenpräsentation trägt zur Induktion von CD4-T-Helferzellen bei. Zusätzlich zu HLA-Molekülen können Epithelzellen auf ihrer Oberfläche HLA-ähnliche Moleküle exprimieren, die ebenfalls eine Rolle bei der Antigenpräsentation zu spielen scheinen. Proinflammatorische Zytokine wie IL-1 und TNF-a sowie eindringende und adhärierende Bakterien induzieren die epitheliale Expression von IL-8, IL-6, GM-CSF, MCP-1, TGF-b, Adhäsionsmolekülen, PGE2, MHC-Klasse I- und II-Antigenen sowie von Akut-Phase-Proteinen, die selbst wiederum durch autokrine und parakrine Mechanismen regulatorische Funktionen auf intestinale Epithelzellen ausüben. Insbesondere die Chemokine MCP-1 und IL-8 haben die Fähigkeit, die intestinale Entzündung zu initiieren und zu perpetuieren. Dies wird erreicht durch eine verstärkte Zellaktivierung sowie eine vermehrte Transmigration von Neutrophilen durch epitheliale Strukturen, was letztendlich histomorphologisch zu den für die chronisch entzündliche Darmerkrankung typischen Kryptenabszessen führt. Erhöhte mukosale Konzentrationen von IL-8 und MCP-1 sind in akut entzündeten Läsionen im Vergleich zu nicht-entzündeten Gewebsabschnitten bei chronisch entzündlicher Darmerkrankung nachgewiesen worden. Dabei konnte gezeigt werden, daß IL-8 und MCP-1 im Entzündungsprozeß nicht nur von mononukleären Zellen der Lamina propria, sondern auch von Epithel- und Endothelzellen sezerniert werden. Proinflammatorische Zytokine wie IL-1 und TNF-a, die in erhöhter Konzentration in der Lamina propria von Patienten mit aktiver wie auch inaktiver chronisch entzündlicher Darmerkrankung nachgewiesen worden sind, stimulieren transformierte und frisch isolierte intestinale Epithelzellen zur Proteinsekretion und mRNA-Expression von IL-8 und MCP-1, so daß das intestinale Epithel die Migration von Neutrophilen und Monozyten und somit die mukosale Entzündung analog dem vaskulären Endothel beeinflussen kann. Das Endothel spielt eine entscheidene Rolle beim Einstrom von Leukozyten aus dem Blut ins Gewebe. Dieses Phänomen wird durch Adhäsionsmoleküle sowohl auf Leukozyten als auch auf Endothelzellen vermittelt. Selektine wie ELAM-1 bestimmen den primären Kontakt zwischen Leukozyten und Endothelzelloberfläche. E- und P-Selektin werden auf zytokinaktivierten Endothelzellen exprimiert. L-Selektin hingegen wird dauerhaft auf Leukozyten in der Zirkulation ausgebildet. Die Selektin-vermittelte Bindung führt zu einer Steigerung der Expression von Integrinen auf Leukozyten und in der Folge zu ihrer Interaktion mit Membranproteinen der Immunglobulin-Superfamilie. Integrine sind außerdem von entscheidender Bedeutung beim sogenannten "homing," das heißt dem Wiedereinwandern von gereiften Lymphozyten in die Darmwand. Insgesamt fand sich bei CED eine deutlich vermehrte Expression fast aller bisher untersuchten Adhäsionsmoleküle, wie zum Beispiel ICAM-1, ELAM-1, verschiedene Integrine sowie der E-, P- und L-Selektine. Obwohl in der gesunden Darmschleimhaut normalerweise keine unmittelbare Nachbarschaft zwischen Epithelzellen und mikrovaskulären Endothelzellen besteht, nehmen wir nach derzeitigem Wissensstand an, daß zwischen beiden Zellpartnern eine Interaktion über lösliche Faktoren stattfindet, in dessen Verlauf verschiedene Zellfunktionen moduliert und induziert werden. Darüber hinaus muß angenommen werden, daß im Rahmen von entzündlichen Prozessen mit begleitender Läsion der epithelialen Basalmembran direkte Interaktionen zwischen Epithel- und Endothelzellen auftreten. In der Literatur war diesem Aspekt bis zur letzten Antragsstellung so gut wie keine Beachtung geschenkt worden.
2.	Ausgangsfragestellung Im Rahmen des seit Juli 1998 geförderten Projektes sollte untersucht werden, ob durch die Kokultivierung von humanen intestinalen Epithelzellen und humanen intestinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HIMEC) eine wechselseitige Beeinflussung beider Zellpartner moeglich ist. Als in vitro-Modell wurde hierfür ein Zweikammersystem eingesetzt, das einerseits der in vivo vorliegenden Situation möglichst nahe kommt, andererseits aber modulierende Effekte der angeborenen und spezifischen Immunität ausschließt. Dabei sollten folgende Fragestellungen bearbeitet werden: Sezernieren intestinale Epithelzellen in einem 2-Kammer-Kokultursystem lösliche Faktoren, die zellbiologische und morphologische Veränderungen in HIMEC induzieren? Sezernieren umgekehrt HIMEC im Sinne einer Antwort auf Signale aus Epithelzellen loesliche Faktoren, die zellbiologische und morphologische Veraenderungen in letzteren Zellen induzieren? Welche Rolle spielt der direkte Kontakt von intestinalen Epithelzellen und HIMEC in einem Ein-Kammersystem im Vergleich zur Kokultivierung mit Trennung beider Zellpartner durch eine Membran (Transwells)? Serumfaktoren sind Induktoren von Differenzierungs- und Syntheseleistungen. Sind, wie für Chondrozyten und makrovaskulaere Endothelzellen beschrieben, serumfreie Kulturbedingungen auch für intestinale Epithelzellen und HIMEC möglich?
3.	Angewandte Methoden Die Isolierung und Kultivierung humaner intestinaler Epithelzellen und HIMEC ist in unserem Labor etabliert. Für die neu durchgeführten Experimente greifen wir primär auf humane Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) zurück. Die Ergebnisse werden in einem weiteren Ansatz mit HIMEC verifiziert. Zur Untersuchung des zellulären Dialogs von intestinalen Epithelzellen und HIMEC wurden Zellkulturexperimente parallel in gemischter Monokultur auf einer Fläche oder in kompartimentalisierten Kokulturen in speziellen Zellkultur-Einsätzen (Transwells) angesetzt. Die Identifizierung von möglichen Kandidat-Faktoren erfolgte durch Zugabe von funktionsblockierenden Antikörpern. Die quantitative und/oder qualitative Nachweis von Zytokinen erfolgte auf Proteinebene durch kommerziell verfügbare ELISA-Methoden oder durch intrazelluläre Zytokinbestimmung mittels Flowzytometrie und wurde in einem zweiten Schritt durch mRNA-Nachweis im Northern-Blot-Verfahren bestätigt. Mögliche Veränderungen der Proteinexpression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen als Antwort auf Signale aus Epithelzellen wurden durch FACS-Analysen bestimmt. Alle hier aufgeführten Methoden sind seit längerem im Labor der Antragssteller etabliert. Die durchgeführten FACS-Analysen werden in Zusammenarbeit mit dem Institut für Immunologie (Direktor: Prof. Dr. rer. nat. E. Kölsch), mit dem eine langjährige Kooperation besteht, durchgeführt.
4.	Ergebnisse Das Teilprojekt B6 wird seit Juli 1998 gefördert. Die in der Vorantragsphase und der jetzigen Förderungsphase für das Teilprojekt B6 erzielten wesentlichen Ergebnisse sind den Fragestellungen 1 und 3 zuzuordnen. Auf der Basis des hier angewandten Kokulturmodells konnten wir zeigen, daß intestinale Epithelzellen in vitro über die Sekretion löslicher Faktoren aktiv mit HIMEC interagieren. So hemmen nicht aktivierte intestinale Epithelzellen konzentrationsabhängig die endotheliale IL-8-Produktion. Ein wesentlicher löslicher Faktor bei diesem zellulären Dialog ist TGF-b1. Daß die hier beschriebene Interaktion zwischen Epithelzellen und HIMEC möglicherweise komplexer ist als bisher angenommen, zeigen parallel angesetzte Zellkulturexperimente in gemischter Monokultur auf einer Fläche oder in kompartimentalisierten Kokulturen in speziellen Zellkultur-Einsätzen: So ist die Suppression der IL-8-Produktion in HIMEC signifikant stärker, wenn beide Zelltypen in einem Kompartiment kokultiviert werden. Ausgehend von diesen Daten vermuten wir eine Beteiligung weiterer Faktoren, die Zell-Zell-Kontakt abhängig sind. In weiterführenden Experimenten konnte ein entscheidender Schritt im Verständnis der Aktivierungsmodalitäten und Effektorfunktionen intestinaler Epithelzellen im Hinblick auf die Produktion von NFkB in Endothelzellen erzielt werden. So konnte gezeigt werden, daß intestinale Epithelzellen, die mit TNF-a vorinkubiert wurden, in einer sich daran anschliessenden Kokultivierung mit Endothelzellen (HUVEC und HMEC) einen deutlichen Anstieg der freigesetzten intrazellulären NFkB-Untereinheit p65 in Endothelzellen im Western Blot bewirken. Die Inkubation der HUVEC mit konditioniertem Ueberstand führte zu keiner Veraenderung der p65 Freisetzung, ebenso die Kokultivierung mit IL-1b aktivierten Epithelzellen. Im weiteren sollen diese Ergebnisse durch Nachweis der DNA-Bindungsaktivität im Bandshift Assay und die Beteiligung der verschiedenen Untereinheiten am Bandshift-Komplex im Super-Shift-Assay bestaetigt werden. In weiteren Experimenten stellten wir fest, daß konditionierte Medien von Caco-2 Zellen sowie intestinalen Epithelzellen, die mit TNF-a oder IL-1b stimuliert wurden, HUVECs zu einer massiven Produktion von VCAM-1 anregen, was in FACS-Analysen dokumentiert werden konnte. Die Resultate unter Fragestellung 3 erscheinen uns so interessant, daß wir die unter Fragestellung 2 beschriebenen Experimente erst in der nächsten Förderphase beginnen werden. Der unter Fragestellung 4 angeführte Aspekt der Etablierung serumfreier Kulturbedingungen für Epithelzellen und HIMEC ist in der Kürze der bisherigen Förderungszeit nicht gelungen. Die Gründe, warum sich intestinale Epithelzellen und HIMEC nicht, wie für Chondrozyten beschrieben, serumfrei kultivieren lassen, sind bislang nicht geklärt. Dieser experimentelle Ansatz (Fragestellung 4) wird weiter intensiv in Kooperation mit Herrn Prof. P. Bruckner, Institut für Physiologische Chemie und Pathobiochemie, der seit Jahren serumfreie Kultursysteme für Chondrozyten und makrovaskuläre Endothelzellen verwendet (Bruckner et al., 1998), sowie mit Herrn Prof. K. Schulze-Osthoff, Institut für Experimentelle Dermatologie, bearbeitet.
5.	Zellbiologische Bedeutung der Ergebnisse Ausgehend von den bisher erhaltenen Daten würde dem Epithel in vivo eine bisher noch nicht zugesprochene Rolle obliegen: Neben der epithelialen Produktion von proinflammatorischen Zytokinen sowie der Chemokine IL-8 und MCP-1, wodurch ein initialer Gradient für die Rekrutierung von Neutrophilen aus den Blutgefäßen in die benachbarte Mukosa via Epithel geschaffen wird, könnten intestinale Epithelzellen andererseits auch über die Suppression der Chemokin-Produktion in Endothelzellen die fortwährende Rekrutierung von Entzündungszellen einschränken. Da nach eigenen Daten und deren anderer Arbeitsgruppen die IL-8- und MCP-1-Produktion in intestinalen Epithelzellen in vitro zeitabhängig abnimmt (in vitro maximale Produktion nach 2-3 (mRNA) bzw. 4 (Protein) Stunden, herrscht die epitheliale TGF-b-Antwort schließlich vor (in vitro kontinuierlicher Anstieg der Proteinproduktion über eine Kultivierungszeit von 120 Stunden). Ausgehend von dieser Hypothese wäre dieser aufgeführte Mechanismus pathophysiologisch sehr relevant, da andere Immunzellen, wie Monozyten/Makrophagen, proinflammatorische Zytokine bei der intestinalen Entzuendung in großen Mengen freisetzen und damit die IL-8- und E-Selektin-Produktion in Endothelzellen stark heraufregulieren. Aufgrund seiner einzigartigen Position, aus der die Auseinandersetzung mit einer Vielzahl von Antigenen resultiert, könnte dem intestinalen Epithel durch die Produktion einer Vielzahl von löslichen Mediatoren demnach die Rolle eines homöostatischen Regulators zukommen. Diese These wird durch die Beobachtung gestützt, daß die erste Veränderung in der TGF-b-Null-Maus eine gesteigerte Leukozyten-Endothel-Adhäsion und granulozytäre Gewebsinfiltration ist.
6.	Stellung des Projektes innerhalb und außerhalb des Sonderforschungsbereiches Bis zum Zeitpunkt des Beginns der Antragsstellung wurde dem Aspekt der Epithel.-Endothel-Interaktion in der Literatur so gut wie keine Beachtung geschenkt. Unabhängig von unseren Arbeiten und vor Publikation der in der bisherigen Phase erzielten Ergebnisse erschien im September 1998 ein Artikel, der - auch hier auf der Basis eines in vitro Kokultursystems - eine grundlegende funktionelle Interaktion von Endothel - und Epithelzellen beschreibt, die für Regulation mukosaler Immunantworten vor allem in der Entzündung von entscheidender Bedeutung sein könnte (Colgan et al., 1998). Der Antragssteller PD Dr. N.Lügering absolviert vom 01.11.98 bis April 1999 ein Stipendium an der University of San Diego, CA (Professor MF Kagnoff), welches sich inhaltlich und methodisch mit der Thematik der Epithel-Endothelinteraktion beschäftigt. MF Kagnoff ist auf dem Gebiet der Epithelzellimmunologie im Intestinaltrakt weltweit mit führend.
7.	Offene Fragen Zusammenfassend stellen wir einen zellulären Dialog zwischen intestinalen Epithelzellen und HIMEC auf der Basis eines in vitro Kokultur-Modells dar. Der Einfluss löslicher Faktoren des Epithels auf die Aktivierung des Endothels kann in vivo kaum nachvollzogen werden. Die Akzeptanz dieser inhaltlich neuen Thematik spiegelt sich in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen auf dem Gebiet der zellulären Interaktion von Epithel- und Endothelzellen wider. Es bleibt vorerst offen, wie der hier beschriebene zelluläre Dialog bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa verläuft. Insbesondere bleibt zu ergründen, unter welchen zellbiologischen Konditionen intestinale Epithelzellen das intestinale Entzündungsgeschehen positiv oder negativ beeinflussen. Das Projekt könnte damit neue Aspekte zur Entstehung und zum Verlauf der entzündlichen Infiltrate bei CED eröffnen und möglicherweise therapeutische Wege zur Behandlung dieser chronischen Erkrankung ebnen.

Drittmittelgeber:

Deutsche Forschungsgemeinschaft

Beteiligte Wissenschaftler:

PD Dr. med. Norbert Lügering (Teilprojektleiter), Dr. med. Torsten Kucharzik (Teilprojektleiter), Prof. Dr. med. Reinhard Stoll (Teilprojektleiter), Prof. Dr. med. Dr. h. c. Wolfram Domschke (Teilprojektleiter)

Veröffentlichungen:

Kucharzik, T., N. Lügering, H. Weigelt, M. Adolf, W. Domschke, R. Stoll: Immunoregulatory properties of Interleukin-13 in patients with inflammatory bowel disease. Comparison with Interleukin-4 and Interleukin-10. Clin Exp Immunol 1996; 104: 483-90.

Lügering, N., T. Kucharzik, M. Fisahn, W. Domschke, R. Stoll: Crohnïs disease (CD) patients suffering from peripheral arthritis or ankylosing spondylitis reveal restricted T cell receptor Vß regions in different temporal phases of disease. Clin Exp Immunol 1996; 105: 278-84.

Lügering, N., T. Kucharzik, G. Winde, C. Sorg, W. Domschke, R. Stoll: Importance of combined treatment with IL-10 and IL-4, but not IL-13, for inhibiting monocyte release of the Ca2+-binding protein MRP8/14. Immunology 1997; 91; 130-134.

Kucharzik, T., N. Lügering, M. Adolf, W. Domschke, R. Stoll: Synergistic effect of immunoregulatory cytokines on peripheral blood monocytes from patients with inflammatory bowel disease. Dig Dis Sci 1997; 42; 805-12.

Lügering, N., T. Kucharzik, H. Stein, G. Winde, A. Hasilik, W. Domschke, R. Stoll: IL-10 synergizes with IL-4 and IL-13 in inhibiting lysosomal enzyme secretion by human monocytes and lamina propria mononuclear cells from patients with inflammatory bowel disease. Dig Dis Sci 1998;43:706-714.

Kucharzik, T., N. Lügering, G. Winde, W. Domschke, R. Stoll: Colon carcinoma cell lines stimulate monocytes and lamina propria mononuclear cells to produce IL-10. Clin Exp Immunol 1997; 110: 296-302.

Kucharzik, T., N. Lügering, K.W. Schmid, M.A. Schmidt, R. Stoll, W. Domschke: Human intestinal M cells exhibit enterocyte like intermediate filaments. Gut 1998; 42:54-62.

Kucharzik, T., N. Lügering, H.G. Pauels, W. Domschke, R. Stoll: IL-4, IL-10 and IL-13 down-regulate monocyte-chemoattracting protein-1 (MCP-1) production in activated intestinal epithelial cells. Clin Exp Immunol 1998; 111:152-157.

Lügering, N., T. Kucharzik, H. Gockel, C. Sorg, R. Stoll, W. Domschke: Human intestinal epithelial cells down-regulate IL-8 expression in human intestinal microvascular endothelial cells; Role of TGF-b1. Clin Exp Immunol 1998; 114: 377-384

Lügering, N., T. Kucharzik, G. Winde, R. Stoll, W. Domschke: TGF-b1 produced by colonic carcinoma cells down-regulates IL-8 expression in a human microvascular endothelial cell line. Auszeichnung auf dem 6. Europäischen Kongreß für Gastroenterologie in Birmingham/England (10/97) mit dem Wissenschaftspreis der Kategorie ïTumormedizin`.