Teilprojekt A10 (Nacken/Sorg): Analyse einer MRP14(-/-)"knock out"-Maus

Projektleiter:	Dr. rer. nat. Wolfgang Nacken, Prof. Dr. rer. nat. Clemens Sorg
Dienstanschrift:	Institut für Experimentelle Dermatologie Von-Esmarch-Str. 56, 48149 Münster
Telefon:	(0251) 8354 6584, (0251) 835 6577/78
Telefax:	(0251) 835 6549
E-Mail:	nacken@uni-muenster.de, sorg@uni-muenster.de

Zahlreiche Publikationen weisen darauf hin, daß MRP8 und MRP14, zwei Calcium-bindende Proteine der S100-Familie, die in myeloiden Zellen sehr stark exprimiert werden, eine prominente Rolle bei entzündlichen Prozessen spielen. Die Funktion der S100-Proteine ist momentan Gegenstand intensiver Forschung. Man weiß insgesamt sehr wenig über die genauen Funktionen nicht nur der S100-Proteine, sondern vieler Calcium-bindenden Proteine. Über die Calcium-bindende Eigenschaft der MRPs kann man annehmen, daß sie eine Rolle bei der Regulation des intrazellulären Ca2+-Haushaltes - insbesondere in Granulozyten im Hinblick auf die große Menge, die dort exprimiert wird - spielen. MRP8 und MRP14 werden aber auch in Monozyten und Epithelzellen im Rahmen eines Entzündungsgeschehens exprimiert und sind nur zwei von zumindest vier Calcium-bindenden S100-Proteinen in diesen Zellen (außer MRP8, MRP14 noch Psoriasin, S100A12). Das deutet auf spezifischere Funktionen hin als die eines Ca2+-Puffers. Unklar ist auch, welche Funktion das Heterodimer auf der Zelloberfläche ausübt. Neuere Ergebnisse deuten darauf hin, daß extra-zelluläres MRP14 die Expression und die Affinität des ß2-Integrins (MAC-1) auf Granulozyten und Monozyten zu regulieren vermag und daß MRP8 durch die Bildung des Heterodimers diese Aktivität inhibiert. Daten aus unserer Gruppe zeigen zudem, daß MRP14 auch die Expression von E-Selektin auf aktivierten Endothelzellen herabreguliert. Damit scheint eine wichtige Funktion von MRP8 und MRP14 bei der Adhäsion und Transmigration der Granulozyten/Monozyten an das entzündete Epithel zu sein. Auch können sie möglicherweise über die Bindung der MRP's an Proteine des Cytoskeletts das Migrationsverhalten myeloischer Zellen Ca-abhängig steuern. Kürzlich konnte nachgewiesen werden, daß der der MRP8/14 Komplex spezifisch Arachidonsäure bindet. Um diese pleiotropen Funktionen in ihrer Relevanz für Entzündungsreaktionen zu analysieren, sind sogenannte 'knock out'-Mäuse, in denen das MRP8 oder MRP14-Gen oder beide Gene deletiert sind, besonders geeignet. Ziel des Projektes A10 von 1996 war die Herstellung von sogenannten MRP8 und MRP14 "Knock-out" Mäusen, um die Funktion dieser beiden myeloid exprimierten S100-Proteine am Tiermodell studieren zu können. Die Herstellung sogenannter knock-out Mäuse ist seit der erstmaligen Beschreibung 1989 zu einer der zentralen und aussagekräftigsten Methoden der modernen Molekulargenetik geworden und insbesondere zur Entschlüsselung einer Genfunktion unentbehrlich. Das Projekt A10 wurde von den Gutachtern in eine Zentrale Serviceeinheit "Transgene Tiere" umgewandelt, um zunächst die notwendigen Techniken zu etablieren und diese über das einzelne Projekt hinaus auch anderen Gruppen zur Verfügung zu stellen. Seit 1996 wird daher im Rahmen des SFB 293 eine zentrale Projektgruppe "Transgene Tiere" gefördert. Mit Hilfe dieser Fördermittel konnten alle Techniken zur Herstellung von `knock out'-Mäusen in Münster etabliert werden:

• Isolierung und Charakterisierung der genomischen MRP8/MRP14 Klone
• Etablierung einer ES-Zellkultur: Herstellung von primären, embryonalen Feederzellen, Herstellung und Optimierung eines LIF Überstandes
• Elektroporation von ES-Zellen
• PCR genomischer DNA zum Nachweis eines single copy MRP14 Gens
• Isolierung von Blastozysten, Injektion von ES-Zellen in Blastozysten und Transfer in Fostermäuse.

Ergebnisse und Vergleich mit der internationalen Konkurrenz Bis zum Sommer 98 konnten zwei Gruppen in Münster sogenannte 'knock-out' Mäuse herstellen (Prof. Brosius, Exp. Pathologie, ZMBE; Prof Sorg, Exp. Dermatologie). Damit wurde schon nach zwei Jahren das primäre Ziel der Zentralen Einheit erreicht. Es wurde uns bei der damaligen Begutachtung des Projektes die Möglichkeit gegeben, nach der Herstellung einer MRP-'knock-out' Maus, einen Nachantrag zu stellen. Da wir im Frühsommer '98 eine MRP14(-/-) Maus zur Verfügung hatten, haben wir im Juni '98 den Nachantrag zum damals beantragten Teilprojekt A10 im SFB 293 gestellt. Wie eingangs erwähnt, war das Ziel der Förderperiode 1996-1999 war die Herstellung einer MRP8 und einer MRP14 knock-out Maus. Dazu wurden beide Gene aus einer genomischen Bank isoliert und die genomischen Locus molekular charakterisiert. Mit Hilfe dieser Daten ließen sich sogenannte "gene targeting"-Konstrukte für beide Gene herstellen. In diesen Konstrukten ist ein Teil des zweiten Introns und des zweiten Exons deletiert und ein Neomycin Gen inseriert. Die Konstrukte wurden in ES-Zellen transfiziert und mehrere homolog rekombinierte ES-Zellklone wurden isoliert. Zu diesem Zeitpunkt erfuhren wir, daß die Gruppe von David Hume, University of Queensland, Australien, im Begriff war, eine MRP8 (CP-10) knock-out Maus herzustellen bzw diese möglicherweise schon hergestellt hatten. Daher fokussierten wir unsere Anstrengungen auf die Herstellung einer MRP14 knock-out Maus. Zellen von vier MRP14(-/-) ES-Zellklonen wurden in Maus-Blastozysten injiziert und diese in scheinschwangere Mäuse transferiert. Anschließend konnten aus den chimären Mäusen zunächst heterozygote MRP14(+/-) und letztlich homozygote MRP14(-/-) Mäuse gezüchtet werden. Es konnte im Western-blot gezeigt werden, daß die Leukozyten dieser MRP14(-/-) Mäuse kein MRP14 mehr haben. Auch auf der Ebene der genomische DNA konnte mittels PCR und Southern blots die MRP14-Defizienz gezeigt werden.

Anfang `98 erfuhren wir konkret, daß die Gruppe von D. Hume in Australien eine MRP8-defiziente Maus herstellen konnte (David Hume, persönliche Mitteilung). Da MRP8 unerwarteterweise im Trophoblasten exprimiert wird und möglicherweise für die Einnistung des Embryos in die Uterusschleimhaut notwendig ist, wird der Embryo zwischen Tag 8 und 10 p.c. resorbiert. Die MRP14 negative Maus ist hingegen lebensfähig und scheint, zumindest bis heute, d.h. bis zu einem Alter von 6 Monaten, keine lebenseinschränkenden Defekte zu haben. Abgesehen von der nicht lebensfähigen MRP8(-/-) Maus ist unseres Wissens die MRP14(-/-) Maus erste "knock out" Maus eines S100 Proteins.

Western-blot-Experimente zeigten überraschenderweise, daß weder mit dem aMRP14-AK noch mit dem mMRP8-AK (beide polyklonal) in den MRP14(-/-) Mäusen ein Signal in peripheren Leukozyten zu entdecken ist. Es scheint somit, daß in MRP14(-/-) Mäusen zumindest in peripheren Leukozyten kein MRP8 vorhanden ist. In Milz konnte immunhistologisch geringe Mengen MRP8 nachgewiesen werden. Im MRP14(-/-)-Knochenmark hingegen entspricht der Anteil der MRP8 positiven Zellen dem einer wt-Maus. In der RT-PCR ist ein MRP8 Transkript in allen untersuchten Geweben nachweisbar (vorläufige Mitteilung, Northern noch nicht gemacht). Im Southern blot konnte die Integrität des MRP8 locus in der MRP14(-/-) Maus nachgewiesen werden. Da die MRP14(-/-) Mäuse lebensfähig sind, muß MRP8 jedoch zumindest in den MRP14(-/-) Mäusen im Embryonalstadium normal exprimiert werden.

Ansonsten konnte bis heute kein auffälliger Phänotyp bei den k.o. Mäusen beobachtet werden Vorläufige Daten zeigen im Blutbild bezüglich der myeloiden Zellen keinerlei Auffälligkeiten, die Zahl und Morphologie der Zellen erscheint normal.

Drittmittelgeber:

Deutsche Forschungsgemeinschaft; Ministerium für Schule und Weiterbildung, Wissenschaft und Forschung des Landes NRW

Beteiligte Wissenschaftler:

Prof. Dr. Clemens Sorg (Teilprojektleiter), Dr. Wolfgang Nacken (Teilprojektleiter), Dr. Dr. Marie-Pierre Manitz (WM)
Kollaborationen: Dr. Thomas Vogl, Dr. Frank Schönlau

Veröffentlichungen:

Nacken, W., M.P. Manitz, C. Sorg: Molecular characterisation of the genomic locus of the mouse MRP8 gene - (1996) - Biochim. Biophys Acta 1215 (1) : 1-5

Klempt, M., H. Melkonyan, W. Nacken, D. Wiesmann, U. Holtkemper, C. Sorg: The heterodimer of the Ca2+-binding proteins MRP8 and MRP14 binds to arachidonic acid - 1997 - FEBS Lett 12; 408 (1) : 81-4