Teilprojekt A9 (Bruckner): Entzündliche Gelenkserkrankungen: Parakrine Wechselwirkung von
Entzündungszellen mit Chondrozyten in vitro
Projektleiter: | Univ.-Prof. Dr. phil. Peter Bruckner |
Dienstanschrift: | Institut für Physiologische Chemie & Pathobiochemie Waldeyerstrasse 15, 48149
Münster |
Telefon: | (0251) 835
5591 |
Telefax: | (0251) 835
5596 |
E-Mail: | pibi@uni-muenster.de |
1. |
Kenntnisstand bei der letzten Antragstellung und Ausgangsfragestellung
Rheumatoide Arthritis ist das Ergebnis von entzündlichen Aktivitäten im Gelenk. Für die
initiale
Auslösung der Pathogenese kommen viele Szenarien in Frage, aber für die Chronifizierung ist die
Aktivierung von Entzündungszellen, vorab von Monozyten / Makrophagen kennzeichnend. Diese wandern
in
verschiedene Gewebsbereiche der Gelenke ein und wechselwirken dort mit ansässigen Bindegewebszellen
(z.B.
Chondrozyten, Synovialzellen). Daraus resultiert eine Aktivierung von katabolen Prozessen, vermutlich in beiden
Zellpopulationen, die zur pathologischen Gewebedestruktion führt. Vergleichbare zelluläre
Wechselwirkungen sind aber auch unter physiologischen Bedingungen bedeutsam, z.B. beim Gewebsumbau von
Knorpel in Knochen bei der enchondralen Ossifikation. Ein Grossteil der Kontaktaufnahme der
Entzündungszellen mit den mesenchymalen Zelltypen besteht nicht in direkten
Zell-Zell-Wechselwirkungen,
sondern in parakriner Kommunikation. Die löslichen Mediatoren, die die jeweiligen Zielzellen über
grosse
Diffusionsstrecken erreichen, und die von diesen ausgelösten Zellveränderungen auf molekularer
Ebene
sind nach wie vor nur fragmentarisch bekannt. Die Aufklärung dieser Wechselwirkungen ist das Thema
unseres
Projektes. Es war schon bekannt, dass subchondrale Blutgefässe für die Degeneration und den Abbau
von
Knorpel bei der enchondralen Ossifikation essentiell sind. Deshalb interessierten wir uns spezifisch für
den
parakrinen Cross-Talk zwischen Chondrozyten und primären Monozyten / Makrophagen. Dazu hatten wir
zu
Beginn der Förderperiode ein geeignetes, serumfreies Kulturmodell zu etablieren, weil Seren
Entzündungsmediatoren und chemotaktische Agentien in unbekannter Zusammensetzung enthalten, welche
die
interessierenden Vorgänge nachhaltig beeinflussen. |
2. |
Angewandte Methoden
2.1 |
Zellen
Die serumfreie Monokultur von Chondrozyten stand dem Arbeitskreis bereits zur Verfügung. Diejenige
von
Monozyten war dagegen noch zu entwickeln. Ferner wollten wir die Zelltypen in Kokultur halten, wobei die
nachfolgende Analyse der metabolischen Leistungen für jede Population auch separat möglich zu
sein
hatte. Sowohl Monozyten als auch Chondrozyten können in Agarose- stabilisierten Suspensionskulturen
überleben, was deren Kokultur in getrennten Schichten derselben Petrischale ermöglicht. Diese
Anordnung lässt die parakrine Zellkommunikation zu, verhindert aber direkte Zell-Zell-Kontakte. Nach
erfolgter
Kokultur können die Zelltypen wieder getrennt und einzeln analysiert werden. Auf die Verwendung
etablierter
Zelllinien wurde verzichtet, weil davon ausgegangen werden muss, dass immortalisierte Monozytenlinien sich von
primären Zellen in ihrer Regulierbarkeit durch lösliche Mediatoren wesentlich unterscheiden. Linien
von
differenzierten Chondrozyten stehen als reine Zellpopulation nicht zur Verfügung. Deshalb wurden
primäre Monozyten aus Buffy Coats durch Dichtegradientzentrifugation gereinigt und in Kokultur mit
Chondrozyten gehalten (siehe 3.1). Chondrozyten wurden durch Kollagenaseverdau aus Sterna embryonaler
Hühnchen oder aus Explantaten von menschlichem Gelenks- oder Rippenknorpel freigesetzt und in
Agarosegelen kultiviert. Ausserhalb des Projektes wurden auch serumfreie Kulturverfahren für
primäre
Aortenendothelzellen des Schweins sowie menschliche Kapillarendothelzellen entwickelt (1). |
2.2 |
Proteinchemische Analysen von Matrixmakromolekülen und - Proteasen
Neusynthetisierte Knorpelkollagene wurden metabolisch mit radioaktivem Prolin markiert, durch limitierte
Pepsinbehandlung und differenzierte Salzfällung gereinigt und durch SDS-PAGE typisiert. Mit
radioaktivem
Sulfat markiertes Aggrecan wurde durch Elektrophorese in Agarose analysiert. Die Aktivität von in die
Kulturmedien ausgeschiedenen Proteasen wurde durch Zymogramme (Trennung der Proteine durch SDS-PAGE
in
Substrat-haltigen Gelen) erfasst. |
2.3 |
Isolierung von RNA aus Agarosekulturen und molekularbiologische Untersuchungen
Ein wichtiger Nachteil zu Beginn der Förderperiode war, dass effiziente RNA-Isolierungsverfahren
für
Agarosekulturen nicht zur Verfügung standen. Dieses Problem konnte jetzt gelöst werden. Totale
RNA
wurde aus Agarosekulturen von Chondrozyten durch Extraktion mit LiCl gewonnen. Die bis anhin schwierig zu
realisierende Abtrennung der Agarose von der RNA erfolgte zum Grossteil durch sofortige Zentrifugation der
Kulturhomogenate. Danach wurde rohe RNA durch Fällung in der Kälte durch das in den Extrakten
enthaltene LiCl über Nacht erhalten. Die weitere Reinigung der RNA erfolgte durch Phenolextraktion. Die
steady-state mRNA-Spiegel der Zellen wurden durch RNA-Blotting bestimmt (2). Bei menschlichen
Chondrozyten aus
Gelenkknorpel sind die Mengen an mRNA dafür jedoch zu gering. Deshalb wurde mit der parallelen
Erfassung
der mRNA-Spiegel durch RT-PCR begonnen. |
3. |
Ergebnisse und ihre Bedeutung
3.1 |
Chondrozyten unterstützen mit parakrinen Signalen die Vitalität von Monozyten in serumfreier
Kultur
Für mindestens 4 Wochen ist die serumfreie Kultur von Monozyten aus Buffy Coats durchführbar.
Ähnlich wie Chondrozyten sind Monozyten dabei auf lösliche Vitalitätsfaktoren angewiesen,
die
zwar nicht von den Monozyten selbst, aber von den Knorpelzellen in Kokultur produziert werden. Ohne diese
symbiotische Nachbarschaft sterben Monozyten innerhalb weniger Tage durch Apoptose. Ferner sind
Chondrozytensignale für Monozyten schwach mitogen. Das Kultursystem eignet sich zur Untersuchung der
gegenseitigen Einflüsse der beiden Zelltypen, die im Folgenden beschrieben sind. |
3.2 |
Monozyten beteiligen sich nicht direkt an der Deblockierung der Spätdifferenzierung von
Chondrozyten
Nach der Chondrogenese verharren differenzierte Chondrozyten, z.B. im Gelenkknorpel, in einem Ruhezustand,
in
dem sie nicht proliferieren und metabolisch wenig aktiv sind. In der Wachstumsfuge jedoch schliesst sich eine
Spätdifferenzierung an, die Proliferation von Ruhezellen und verstärkte Matrixsynthese einschliesst
und
schliesslich in das Stadium der Hypertrophie mündet, charakterisiert durch die zusätzliche Synthese
von
Markern wie Kollagen X und alkalischer Phosphatase. Diese Spätdifferenzierung, die letztlich in
Knorpeldegeneration und enchondraler Ossifikation resultieren kann, verläuft spontan und unterliegt in
Permanentknorpel, wie wir kürzlich zeigen konnten (3), einer Negativkontrolle, die an mehreren Stadien
über unterschiedliche Signale eingreift (2). Da den subchondralen Blutgefässen eine bedeutende
Rolle bei
der Knorpeldifferenzierung und beim Gewebsumbau in Knochen zuerkannt wurde, stellten wir die Frage, ob
Monozyten die Spätdifferenzierung in kaudalen sternalen Hühnerchondrozyten deblockieren
können. Eine solche Aktivität wird von Endothelzellen in Form einer Proteasekaskade sezerniert (1),
konnte jedoch in Monozyten nicht gefunden werden. Dies galt sowohl für frisch isolierte Zellen, wie auch
nach
deren Aktivierung durch Lipopolysaccharide (LPS). Wie unter 3.3 ff. ausgeführt, lösen LPS sehr
wohl
andere Effekte aus. Folgende Zelltypen können somit, anders als Endothelzellen, die
Chondrozytenhypertrophie
nicht deblockieren: Fibroblasten, Chondrozyten aller Differenzierungsstadien, glatte Muskelzellen und jetzt auch
Monozyten. Der Sachverhalt, dass aktivierte Monozyten trotz intensiver Produktion von Proteasen die
Hypertrophie
von Chondrozyten nicht deblockieren können, ist bemerkenswert und für die Identifikation der
Endothelproteasen mit diesen Eigenschaften hilfreich. Zu klären bleibt noch, ob sich Monozyten durch
Anregung von Endothelzellen indirekt an der enchondralen Ossifikation beteiligen können. |
3.3 |
Produktion und Degradation von Kollagenen und von Aggrecan in Kokulturen von Monozyten und
Chondrozyten
Die Effektoren, die die Einflüsse der Monozyten auf die Matrixsynthese von Chondrozyten vermitteln,
scheinen
Speziesspezifisch zu sein, wie mit menschlichen Monozyten und Hühnerchondrozyten gezeigt wurde.
Deshalb
wurden Versuche mit humanen Monozyten und humanen Chondrozyten vorgenommen (4), obwohl viele
Experimente
mangels klinisch vergleichbarem Knorpel etwas variabel waren. Die Monozyten übten einen geringen und
vom
Alter der Knorpelspender abhängigen Einfluss auf den Kollagenmetabolismus menschlicher Chondrozyten
aus.
Während frisch isolierte Chondrozyten messbare Mengen von Kollagenen produzierten, nahm die
Neusynthese
schon nach kurzer Kulturdauer stark ab. Die Restmengen an metabolisch markierten Knorpelkollagenen wurden
in
Gegenwart von Monozyten nur wenig, wenn überhaupt, weiter reduziert. Dagegen fand die
Aggrecansynthese
noch lange Zeit auf relativ hohem Niveau statt und wurde konsistent durch Monozyten vermindert, sowohl auf
mRNA-
wie auch auf proteinchemischer Ebene. In Kokulturen mit nicht-aktivierten Monozyten trat ein Abbau des
Aggrecans
in definierte Fragmente auf. Insbesondere war nach LPS-Aktivierung Sulfat-markiertes, neusynthetisiertes
Aggrecan
in den Kokulturen nicht mehr nachweisbar, während neueste, vorläufige RT-PCR-Daten belegen, dass
die
mRNA weiter produziert wird, wenn auch in geringerem Umfang. Diese Beobachtungen zeigen, dass aktivierte
Monozyten in der Lage sind, nach Einwanderung in die Gelenke die Knorpelmatrixsynthese durch direkte
Beeinflussung der Knorpelzellen zu reduzieren. |
3.4 |
Produktion und Aktivierung der MMP-1 (Kollagenase) und MMP-3 (Stromelysin) in Kokulturen
Der parakrine Cross-talk zwischen Chondrozyten und Monozyten rief eine deutlich veränderte Produktion
und
Aktivierung einiger Matrixmetalloproteasen hervor. Diese Veränderungen liessen sich durch Zymographie,
Immunblotting mit spezifischen Antikörpern, sowie durch RT-PCR erfassen. Die Aktivierung von
Kollagenase
(MMP-1) und Stromelysin (MMP-3) wurde in Zymogrammen oder Immunblots durch das Auftreten von Formen
mit
leicht reduzierter Molmasse festgestellt. In frisch isolierten Monozyten konnte weder inaktives noch aktiviertes
MMP-1
gefunden werden. Da dieses Enzym in grossen Mengen in polymorphkernigen Granulozyten vorkommt, konnten
wir
daraus schliessen, dass unsere Monozytenpräparationen frei von diesem Leukozytentyp waren.
Chondrozyten
junger Spender ergaben ebenfalls negative Befunde, während mit zunehmendem Alter zunächst
nicht-aktivierte und später auch aktivierte MMP-1 in bescheidenen und von LPS unbeeinflussten Mengen
nachweisbar waren. Die Kokultur dagegen führte zu einer starken Vermehrung vor allem der
MMP-1-Proprotease. Die Zugabe von LPS hatte eine weitere Steigerung zur Folge und vor allem auch eine
Aktivierung des Enzyms. Vergleichbare Befunde konnten für MMP-3 erhoben werden. Generell liess sich
jedoch nicht die aktivierte Form dieses Enzyms nachweisen. Monozyten waren schwach positiv für
Pro-MMP-3,
während Chondrozyten von alten (80-j.), aber nicht jungen Spendern das Enzym in grossen Mengen
produzierten. Im Gegensatz dazu war eine deutliche Steigerung des Niveaus an Pro-MMP-3 durch Kokultur bei
jungen,
aber nicht alten Spendern zu beobachten. Diese Stimulation wurde durch LPS-Aktivierung der Monozyten weiter
erhöht. Angesichts der Tatsache, dass nur Pro-MMP-3, aber nicht aktives MMP-3 auftrat, bleibt noch
offen,
inwiefern dieses Enzym für den Knorpelabbau, insbesondere von Aggrecan (siehe 3.4), für
Entzündungsszenarien von Bedeutung ist. In der Zukunft werden wir dem MMP-14 unsere Aufmerksamkeit
zukommen lassen, einem membrangebundenen Mitglied der Familie von Matrixmetalloproteasen, das in vielen
Systemen für die Aktivierung anderer MMPs verantwortlich ist. Interessant ist auch der Sachverhalt, dass
in
Kokulturen Kollagenase in aktiver Form produziert wird, die Degradation von neusynthetisiertem Kollagen II
dagegen
eher bescheiden ist. Dies könnte sich dadurch erklären, dass gleichzeitig die Inhibitoren TIMP-1 und
2
stimuliert werden, welche die Matrixdegradation negativ kontrollieren. Bisher wurden von uns noch keine
Erhebungen
zu den TIMPs durchgeführt. |
3.5 |
Produktion und Aktivierung der Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 in Kokulturen
Studien zu den beiden Gelatinasen MMP-2 und -9 wurden analog zu den oben für MMP-1 und 3
beschriebenen
durchgeführt. Wiederum waren Effekte in Kokulturen zu erkennen, die durch Aktivierung der Monozyten
durch
LPS verstärkt auftraten. Dies galt weniger für MMP-2 als für MMP-9. MMP-2 wurde nicht
von
Monozyten aber von Chondrozyten in mehrheitlich nicht aktiver Form produziert. Die Kokultur führte zu
einer
bescheidenen Steigerung, unabhängig von der Zugabe von LPS. Diese Protease ist somit kein
herausragender
Kandidat als Mediator des entzündlichen Knorpelabbaus. Anders sind die Beobachtungen mit MMP-9.
Pro-MMP-9 wird von Monozyten alleine synthetisiert, besonders in Gegenwart von LPS. Chondrozyten alleine
besitzen diese Enzymaktivität nicht, können aber interessanterweise in Kokultur Pro-MMP-9
vollständig in MMP-9 umwandeln. Da dieser Effekt nicht von LPS abhängt, ist die wahrscheinlichste
Interpretation der Befunde, dass Chondrozyten die Protease nicht selbst produzieren, aber diejenige der
Monozyten
aktivieren. Damit konnten wir die Bedeutung des Cross-Talks der beiden Zelltypen für den
Matrixkatabolismus
ein weiteres Mal belegen. |
4. |
Offene Fragen
Einige wichtige Erkenntnisse über das Zusammenwirken von Entzündungs- und Knorpelzellen
konnten
über unseren Ansatz gewonnen werden. Die Kokultur von Chondrozyten und Monozyten / Makrophagen
repräsentiert aber eine vereinfachte Darstellung zellulärer Wechselwirkungen bei
entzündlichen
Arthritiden. Die Rolle von Endothelzellen, möglicherweise in durch Leukozyten aktivierter Form, wurde
bisher
noch nicht in die Untersuchungen mit einbezogen. Nachdem wir im Rahmen eines anderen Projekts auch die
serumfreie Kultur dieser Zelltypen etabliert haben, wird es in der kommenden Förderperiode
möglich
sein, die bisherigen Studien auf ternäre Systeme von Endothelzellen, Monozyten und Chondrozyten
auszuweiten. Die Bedeutung proteolytischer Prozesse beschränkt sich nicht, wie aus den bisherigen
Ergebnissen
deutlich erkennbar, auf den Katabolismus der Knorpelmatrix, sondern kann auf die Deblockierung der
Spätdifferenzierung der Chondrozyten ausgeweitet werden, die besonders für degenerative
Gelenkserkrankungen, sowie die Entwicklung, das Wachstum und die Reparatur von Knochen wichtig ist (siehe
dazu
auch Fortsetzungsantrag). Aus ähnlichen Gründen ist ein weiteres, sich aus bisherigen Arbeiten
ergebendes Thema der Haushalt von Proteaseinhibitoren, den wir bisher noch wenig untersucht haben. Die
Eignung
unseres Ansatzes auch für diese Fragestellung ist offensichtlich. Für menschliche Zellen sind
geeignete
Reagenzien vorhanden und wichtige neue Ergebnisse sind zu erwarten. |
5. |
Vergleich mit Arbeiten ausserhalb des Sonderforschungsbereiches
Die Rolle von Entzündungsmediatoren und Proteasen bei entzündlichen Gelenkserkrankungen wird
weltweit auf breitester Basis erforscht und entsprechend ist auch die Zahl der Publikationen sehr gross. Die
serumfreie
Kultur von Monozyten wurde aber bisher zu unserer Kenntnis noch von keiner Forschergruppe angewendet,
obwohl
die Verwendung von Seren oder anderen undefinierten Kulturzusätzen die Anwesenheit von
Entzündungsmediatoren und deren Antagonisten, sowie von Proteasen und deren Inhibitoren in unbekannter
Zusammensetzung impliziert. Häufig werden auch Chondrozyten in Monolayerkultur untersucht. Dies
besitzt
zwar den Vorteil, dass die Zellen vereinfacht und direkter auf ihre metabolische Leistungen hin untersucht werden
können. Der gravierende Nachteil dieser Kulturbedingung ist aber der instabile Knorpelphänotyp der
Zellen, was die Interpretation erschwert. Das Interesse am Matrixkatabolismus im arthritischen Knorpel
beschränkt sich nicht auf die universitäre Forschung, sondern besteht in erheblichem Umfang auch
wegen
kommerzieller Gesichtspunkte. Deshalb ist der aktuelle Kenntnisstand auf diesem Gebiet nicht leicht beurteilbar.
Auch
für unsere Ergebnisse muss vor deren Publikation in wissenschaftlichen Zeitschriften die Frage der
Patentierbarkeit noch geklärt werden. | |
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Drittmittelgeber:
Beteiligte Wissenschaftler:
Veröffentlichungen:
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