Teilprojekt A9 (Bruckner): Entzündliche Gelenkserkrankungen: Parakrine Wechselwirkung von Entzündungszellen mit Chondrozyten in vitro

Projektleiter:	Univ.-Prof. Dr. phil. Peter Bruckner
Dienstanschrift:	Institut für Physiologische Chemie & Pathobiochemie Waldeyerstrasse 15, 48149 Münster
Telefon:	(0251) 835 5591
Telefax:	(0251) 835 5596
E-Mail:	pibi@uni-muenster.de

1.	Kenntnisstand bei der letzten Antragstellung und Ausgangsfragestellung Rheumatoide Arthritis ist das Ergebnis von entzündlichen Aktivitäten im Gelenk. Für die initiale Auslösung der Pathogenese kommen viele Szenarien in Frage, aber für die Chronifizierung ist die Aktivierung von Entzündungszellen, vorab von Monozyten / Makrophagen kennzeichnend. Diese wandern in verschiedene Gewebsbereiche der Gelenke ein und wechselwirken dort mit ansässigen Bindegewebszellen (z.B. Chondrozyten, Synovialzellen). Daraus resultiert eine Aktivierung von katabolen Prozessen, vermutlich in beiden Zellpopulationen, die zur pathologischen Gewebedestruktion führt. Vergleichbare zelluläre Wechselwirkungen sind aber auch unter physiologischen Bedingungen bedeutsam, z.B. beim Gewebsumbau von Knorpel in Knochen bei der enchondralen Ossifikation. Ein Grossteil der Kontaktaufnahme der Entzündungszellen mit den mesenchymalen Zelltypen besteht nicht in direkten Zell-Zell-Wechselwirkungen, sondern in parakriner Kommunikation. Die löslichen Mediatoren, die die jeweiligen Zielzellen über grosse Diffusionsstrecken erreichen, und die von diesen ausgelösten Zellveränderungen auf molekularer Ebene sind nach wie vor nur fragmentarisch bekannt. Die Aufklärung dieser Wechselwirkungen ist das Thema unseres Projektes. Es war schon bekannt, dass subchondrale Blutgefässe für die Degeneration und den Abbau von Knorpel bei der enchondralen Ossifikation essentiell sind. Deshalb interessierten wir uns spezifisch für den parakrinen Cross-Talk zwischen Chondrozyten und primären Monozyten / Makrophagen. Dazu hatten wir zu Beginn der Förderperiode ein geeignetes, serumfreies Kulturmodell zu etablieren, weil Seren Entzündungsmediatoren und chemotaktische Agentien in unbekannter Zusammensetzung enthalten, welche die interessierenden Vorgänge nachhaltig beeinflussen.
2.	Angewandte Methoden 2.1 Zellen Die serumfreie Monokultur von Chondrozyten stand dem Arbeitskreis bereits zur Verfügung. Diejenige von Monozyten war dagegen noch zu entwickeln. Ferner wollten wir die Zelltypen in Kokultur halten, wobei die nachfolgende Analyse der metabolischen Leistungen für jede Population auch separat möglich zu sein hatte. Sowohl Monozyten als auch Chondrozyten können in Agarosestabilisierten Suspensionskulturen überleben, was deren Kokultur in getrennten Schichten derselben Petrischale ermöglicht. Diese Anordnung lässt die parakrine Zellkommunikation zu, verhindert aber direkte Zell-Zell-Kontakte. Nach erfolgter Kokultur können die Zelltypen wieder getrennt und einzeln analysiert werden. Auf die Verwendung etablierter Zelllinien wurde verzichtet, weil davon ausgegangen werden muss, dass immortalisierte Monozytenlinien sich von primären Zellen in ihrer Regulierbarkeit durch lösliche Mediatoren wesentlich unterscheiden. Linien von differenzierten Chondrozyten stehen als reine Zellpopulation nicht zur Verfügung. Deshalb wurden primäre Monozyten aus Buffy Coats durch Dichtegradientzentrifugation gereinigt und in Kokultur mit Chondrozyten gehalten (siehe 3.1). Chondrozyten wurden durch Kollagenaseverdau aus Sterna embryonaler Hühnchen oder aus Explantaten von menschlichem Gelenks- oder Rippenknorpel freigesetzt und in Agarosegelen kultiviert. Ausserhalb des Projektes wurden auch serumfreie Kulturverfahren für primäre Aortenendothelzellen des Schweins sowie menschliche Kapillarendothelzellen entwickelt (1). 2.2 Proteinchemische Analysen von Matrixmakromolekülen und - Proteasen Neusynthetisierte Knorpelkollagene wurden metabolisch mit radioaktivem Prolin markiert, durch limitierte Pepsinbehandlung und differenzierte Salzfällung gereinigt und durch SDS-PAGE typisiert. Mit radioaktivem Sulfat markiertes Aggrecan wurde durch Elektrophorese in Agarose analysiert. Die Aktivität von in die Kulturmedien ausgeschiedenen Proteasen wurde durch Zymogramme (Trennung der Proteine durch SDS-PAGE in Substrat-haltigen Gelen) erfasst. 2.3 Isolierung von RNA aus Agarosekulturen und molekularbiologische Untersuchungen Ein wichtiger Nachteil zu Beginn der Förderperiode war, dass effiziente RNA-Isolierungsverfahren für Agarosekulturen nicht zur Verfügung standen. Dieses Problem konnte jetzt gelöst werden. Totale RNA wurde aus Agarosekulturen von Chondrozyten durch Extraktion mit LiCl gewonnen. Die bis anhin schwierig zu realisierende Abtrennung der Agarose von der RNA erfolgte zum Grossteil durch sofortige Zentrifugation der Kulturhomogenate. Danach wurde rohe RNA durch Fällung in der Kälte durch das in den Extrakten enthaltene LiCl über Nacht erhalten. Die weitere Reinigung der RNA erfolgte durch Phenolextraktion. Die steadystate mRNA-Spiegel der Zellen wurden durch RNA-Blotting bestimmt (2). Bei menschlichen Chondrozyten aus Gelenkknorpel sind die Mengen an mRNA dafür jedoch zu gering. Deshalb wurde mit der parallelen Erfassung der mRNA-Spiegel durch RT-PCR begonnen.
3.	Ergebnisse und ihre Bedeutung 3.1 Chondrozyten unterstützen mit parakrinen Signalen die Vitalität von Monozyten in serumfreier Kultur Für mindestens 4 Wochen ist die serumfreie Kultur von Monozyten aus Buffy Coats durchführbar. Ähnlich wie Chondrozyten sind Monozyten dabei auf lösliche Vitalitätsfaktoren angewiesen, die zwar nicht von den Monozyten selbst, aber von den Knorpelzellen in Kokultur produziert werden. Ohne diese symbiotische Nachbarschaft sterben Monozyten innerhalb weniger Tage durch Apoptose. Ferner sind Chondrozytensignale für Monozyten schwach mitogen. Das Kultursystem eignet sich zur Untersuchung der gegenseitigen Einflüsse der beiden Zelltypen, die im Folgenden beschrieben sind. 3.2 Monozyten beteiligen sich nicht direkt an der Deblockierung der Spätdifferenzierung von Chondrozyten Nach der Chondrogenese verharren differenzierte Chondrozyten, z.B. im Gelenkknorpel, in einem Ruhezustand, in dem sie nicht proliferieren und metabolisch wenig aktiv sind. In der Wachstumsfuge jedoch schliesst sich eine Spätdifferenzierung an, die Proliferation von Ruhezellen und verstärkte Matrixsynthese einschliesst und schliesslich in das Stadium der Hypertrophie mündet, charakterisiert durch die zusätzliche Synthese von Markern wie Kollagen X und alkalischer Phosphatase. Diese Spätdifferenzierung, die letztlich in Knorpeldegeneration und enchondraler Ossifikation resultieren kann, verläuft spontan und unterliegt in Permanentknorpel, wie wir kürzlich zeigen konnten (3), einer Negativkontrolle, die an mehreren Stadien über unterschiedliche Signale eingreift (2). Da den subchondralen Blutgefässen eine bedeutende Rolle bei der Knorpeldifferenzierung und beim Gewebsumbau in Knochen zuerkannt wurde, stellten wir die Frage, ob Monozyten die Spätdifferenzierung in kaudalen sternalen Hühnerchondrozyten deblockieren können. Eine solche Aktivität wird von Endothelzellen in Form einer Proteasekaskade sezerniert (1), konnte jedoch in Monozyten nicht gefunden werden. Dies galt sowohl für frisch isolierte Zellen, wie auch nach deren Aktivierung durch Lipopolysaccharide (LPS). Wie unter 3.3 ff. ausgeführt, lösen LPS sehr wohl andere Effekte aus. Folgende Zelltypen können somit, anders als Endothelzellen, die Chondrozytenhypertrophie nicht deblockieren: Fibroblasten, Chondrozyten aller Differenzierungsstadien, glatte Muskelzellen und jetzt auch Monozyten. Der Sachverhalt, dass aktivierte Monozyten trotz intensiver Produktion von Proteasen die Hypertrophie von Chondrozyten nicht deblockieren können, ist bemerkenswert und für die Identifikation der Endothelproteasen mit diesen Eigenschaften hilfreich. Zu klären bleibt noch, ob sich Monozyten durch Anregung von Endothelzellen indirekt an der enchondralen Ossifikation beteiligen können. 3.3 Produktion und Degradation von Kollagenen und von Aggrecan in Kokulturen von Monozyten und Chondrozyten Die Effektoren, die die Einflüsse der Monozyten auf die Matrixsynthese von Chondrozyten vermitteln, scheinen Speziesspezifisch zu sein, wie mit menschlichen Monozyten und Hühnerchondrozyten gezeigt wurde. Deshalb wurden Versuche mit humanen Monozyten und humanen Chondrozyten vorgenommen (4), obwohl viele Experimente mangels klinisch vergleichbarem Knorpel etwas variabel waren. Die Monozyten übten einen geringen und vom Alter der Knorpelspender abhängigen Einfluss auf den Kollagenmetabolismus menschlicher Chondrozyten aus. Während frisch isolierte Chondrozyten messbare Mengen von Kollagenen produzierten, nahm die Neusynthese schon nach kurzer Kulturdauer stark ab. Die Restmengen an metabolisch markierten Knorpelkollagenen wurden in Gegenwart von Monozyten nur wenig, wenn überhaupt, weiter reduziert. Dagegen fand die Aggrecansynthese noch lange Zeit auf relativ hohem Niveau statt und wurde konsistent durch Monozyten vermindert, sowohl auf mRNA- wie auch auf proteinchemischer Ebene. In Kokulturen mit nicht-aktivierten Monozyten trat ein Abbau des Aggrecans in definierte Fragmente auf. Insbesondere war nach LPS-Aktivierung Sulfat-markiertes, neusynthetisiertes Aggrecan in den Kokulturen nicht mehr nachweisbar, während neueste, vorläufige RT-PCR-Daten belegen, dass die mRNA weiter produziert wird, wenn auch in geringerem Umfang. Diese Beobachtungen zeigen, dass aktivierte Monozyten in der Lage sind, nach Einwanderung in die Gelenke die Knorpelmatrixsynthese durch direkte Beeinflussung der Knorpelzellen zu reduzieren. 3.4 Produktion und Aktivierung der MMP-1 (Kollagenase) und MMP-3 (Stromelysin) in Kokulturen Der parakrine Cross-talk zwischen Chondrozyten und Monozyten rief eine deutlich veränderte Produktion und Aktivierung einiger Matrixmetalloproteasen hervor. Diese Veränderungen liessen sich durch Zymographie, Immunblotting mit spezifischen Antikörpern, sowie durch RT-PCR erfassen. Die Aktivierung von Kollagenase (MMP-1) und Stromelysin (MMP-3) wurde in Zymogrammen oder Immunblots durch das Auftreten von Formen mit leicht reduzierter Molmasse festgestellt. In frisch isolierten Monozyten konnte weder inaktives noch aktiviertes MMP-1 gefunden werden. Da dieses Enzym in grossen Mengen in polymorphkernigen Granulozyten vorkommt, konnten wir daraus schliessen, dass unsere Monozytenpräparationen frei von diesem Leukozytentyp waren. Chondrozyten junger Spender ergaben ebenfalls negative Befunde, während mit zunehmendem Alter zunächst nicht-aktivierte und später auch aktivierte MMP-1 in bescheidenen und von LPS unbeeinflussten Mengen nachweisbar waren. Die Kokultur dagegen führte zu einer starken Vermehrung vor allem der MMP-1-Proprotease. Die Zugabe von LPS hatte eine weitere Steigerung zur Folge und vor allem auch eine Aktivierung des Enzyms. Vergleichbare Befunde konnten für MMP-3 erhoben werden. Generell liess sich jedoch nicht die aktivierte Form dieses Enzyms nachweisen. Monozyten waren schwach positiv für Pro-MMP-3, während Chondrozyten von alten (80-j.), aber nicht jungen Spendern das Enzym in grossen Mengen produzierten. Im Gegensatz dazu war eine deutliche Steigerung des Niveaus an Pro-MMP-3 durch Kokultur bei jungen, aber nicht alten Spendern zu beobachten. Diese Stimulation wurde durch LPS-Aktivierung der Monozyten weiter erhöht. Angesichts der Tatsache, dass nur Pro-MMP-3, aber nicht aktives MMP-3 auftrat, bleibt noch offen, inwiefern dieses Enzym für den Knorpelabbau, insbesondere von Aggrecan (siehe 3.4), für Entzündungsszenarien von Bedeutung ist. In der Zukunft werden wir dem MMP-14 unsere Aufmerksamkeit zukommen lassen, einem membrangebundenen Mitglied der Familie von Matrixmetalloproteasen, das in vielen Systemen für die Aktivierung anderer MMPs verantwortlich ist. Interessant ist auch der Sachverhalt, dass in Kokulturen Kollagenase in aktiver Form produziert wird, die Degradation von neusynthetisiertem Kollagen II dagegen eher bescheiden ist. Dies könnte sich dadurch erklären, dass gleichzeitig die Inhibitoren TIMP-1 und 2 stimuliert werden, welche die Matrixdegradation negativ kontrollieren. Bisher wurden von uns noch keine Erhebungen zu den TIMPs durchgeführt. 3.5 Produktion und Aktivierung der Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 in Kokulturen Studien zu den beiden Gelatinasen MMP-2 und -9 wurden analog zu den oben für MMP-1 und 3 beschriebenen durchgeführt. Wiederum waren Effekte in Kokulturen zu erkennen, die durch Aktivierung der Monozyten durch LPS verstärkt auftraten. Dies galt weniger für MMP-2 als für MMP-9. MMP-2 wurde nicht von Monozyten aber von Chondrozyten in mehrheitlich nicht aktiver Form produziert. Die Kokultur führte zu einer bescheidenen Steigerung, unabhängig von der Zugabe von LPS. Diese Protease ist somit kein herausragender Kandidat als Mediator des entzündlichen Knorpelabbaus. Anders sind die Beobachtungen mit MMP-9. Pro-MMP-9 wird von Monozyten alleine synthetisiert, besonders in Gegenwart von LPS. Chondrozyten alleine besitzen diese Enzymaktivität nicht, können aber interessanterweise in Kokultur Pro-MMP-9 vollständig in MMP-9 umwandeln. Da dieser Effekt nicht von LPS abhängt, ist die wahrscheinlichste Interpretation der Befunde, dass Chondrozyten die Protease nicht selbst produzieren, aber diejenige der Monozyten aktivieren. Damit konnten wir die Bedeutung des Cross-Talks der beiden Zelltypen für den Matrixkatabolismus ein weiteres Mal belegen.
4.	Offene Fragen Einige wichtige Erkenntnisse über das Zusammenwirken von Entzündungs- und Knorpelzellen konnten über unseren Ansatz gewonnen werden. Die Kokultur von Chondrozyten und Monozyten / Makrophagen repräsentiert aber eine vereinfachte Darstellung zellulärer Wechselwirkungen bei entzündlichen Arthritiden. Die Rolle von Endothelzellen, möglicherweise in durch Leukozyten aktivierter Form, wurde bisher noch nicht in die Untersuchungen mit einbezogen. Nachdem wir im Rahmen eines anderen Projekts auch die serumfreie Kultur dieser Zelltypen etabliert haben, wird es in der kommenden Förderperiode möglich sein, die bisherigen Studien auf ternäre Systeme von Endothelzellen, Monozyten und Chondrozyten auszuweiten. Die Bedeutung proteolytischer Prozesse beschränkt sich nicht, wie aus den bisherigen Ergebnissen deutlich erkennbar, auf den Katabolismus der Knorpelmatrix, sondern kann auf die Deblockierung der Spätdifferenzierung der Chondrozyten ausgeweitet werden, die besonders für degenerative Gelenkserkrankungen, sowie die Entwicklung, das Wachstum und die Reparatur von Knochen wichtig ist (siehe dazu auch Fortsetzungsantrag). Aus ähnlichen Gründen ist ein weiteres, sich aus bisherigen Arbeiten ergebendes Thema der Haushalt von Proteaseinhibitoren, den wir bisher noch wenig untersucht haben. Die Eignung unseres Ansatzes auch für diese Fragestellung ist offensichtlich. Für menschliche Zellen sind geeignete Reagenzien vorhanden und wichtige neue Ergebnisse sind zu erwarten.
5.	Vergleich mit Arbeiten ausserhalb des Sonderforschungsbereiches Die Rolle von Entzündungsmediatoren und Proteasen bei entzündlichen Gelenkserkrankungen wird weltweit auf breitester Basis erforscht und entsprechend ist auch die Zahl der Publikationen sehr gross. Die serumfreie Kultur von Monozyten wurde aber bisher zu unserer Kenntnis noch von keiner Forschergruppe angewendet, obwohl die Verwendung von Seren oder anderen undefinierten Kulturzusätzen die Anwesenheit von Entzündungsmediatoren und deren Antagonisten, sowie von Proteasen und deren Inhibitoren in unbekannter Zusammensetzung impliziert. Häufig werden auch Chondrozyten in Monolayerkultur untersucht. Dies besitzt zwar den Vorteil, dass die Zellen vereinfacht und direkter auf ihre metabolische Leistungen hin untersucht werden können. Der gravierende Nachteil dieser Kulturbedingung ist aber der instabile Knorpelphänotyp der Zellen, was die Interpretation erschwert. Das Interesse am Matrixkatabolismus im arthritischen Knorpel beschränkt sich nicht auf die universitäre Forschung, sondern besteht in erheblichem Umfang auch wegen kommerzieller Gesichtspunkte. Deshalb ist der aktuelle Kenntnisstand auf diesem Gebiet nicht leicht beurteilbar. Auch für unsere Ergebnisse muss vor deren Publikation in wissenschaftlichen Zeitschriften die Frage der Patentierbarkeit noch geklärt werden.

Drittmittelgeber:

Deutsche Forschungsgemeinschaft

Beteiligte Wissenschaftler:

Univ.-Prof. Dr. phil. Peter Bruckner (Teilprojektleiter), Dr. rer. nat. Shona Wallace (WM)

Veröffentlichungen:

Bittner, K., P. Vischer, P. Bartholmes, P. Bruckner: Role of the subchondral vascular system in endochondral ossification: Endothelial cells specifically derepress late differentiation in resting chondrocytes in vitro. Exp. Cell Res.238:491-497 - 1998

Szüts, V., U. Möllers, K. Bittner, G. Schürmann, S. Muratoglu, F. Deák, I. Kiss, P. Bruckner: Terminal differentiation of chondrocytes is arrested at distinct stages identified by their expression repertoire of marker genes. Matrix Biol.17:435-448 - 1998

Erdmann, S., W. Müller, S. Bahrami, S. I. Vornehm, H. Mayer, P. Bruckner, K. von der Mark, H. Burkhardt: Differential effects of parathyroid hormone fragments on collagen gene expression in chondrocytes. J. Cell Biol.135:1179-1191 - 1996